Mèsi paske w vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Thermophiles yo se mikwo-òganis ki byen devlope nan tanperati ki wo. Etidye yo ka bay bonjan enfòmasyon sou fason lavi adapte yo ak kondisyon ekstrèm yo. Sepandan, li difisil pou reyalize kondisyon tanperati ki wo ak mikwoskòp optik konvansyonèl yo. Plizyè solisyon ki fèt lakay yo ki baze sou chofaj elektrik rezistan lokal yo te pwopoze, men pa gen okenn solisyon komèsyal senp. Nan papye sa a, nou entwodui konsèp nan chofaj lazè mikwoskal sou jaden an mikwoskòp de vi bay tanperati ki wo pou etid tèrmofil pandan y ap kenbe anviwònman itilizatè a modere. Mikwoskal chofaj nan entansite lazè modere ka reyalize lè l sèvi avèk yon substra nanopartikul lò kouvwi kòm yon absòbe limyè biokonpatib ak efikas. Yo diskite sou efè posib nan konveksyon likid mikwoskal, retansyon selil, ak mouvman santrifujeur thermophoretic. Metòd la te demontre nan de espès: (i) Geobacillus stearothermophilus, yon bakteri tèrmofil aktif ki repwodui nan apeprè 65 ° C, ke nou te obsève jèmen, grandi ak naje anba chofaj mikwoskal; (ii) Thiobacillus sp., yon archaea optimal hyperthermophilic. nan 80°C. Travay sa a pave wout la pou obsèvasyon senp epi san danje nan mikwo-òganis tèrmofil lè l sèvi avèk zouti mikwoskopi modèn ak abòdab.
Plis pase plizyè milya ane, lavi sou Latè evolye pou adapte yo ak yon pakèt kondisyon anviwònman ki pafwa konsidere kòm ekstrèm nan pèspektiv imen nou an. An patikilye, gen kèk mikwo-òganis tèrmofil (bakteri, archaea, fongis) ki rele thermophiles pwospere nan seri tanperati ki soti nan 45 ° C a 122 ° C1, 2, 3, 4. Thermophiles ap viv nan divès ekosistèm, tankou gwo twou san fon dlo vantilasyon, sous dlo cho. oswa zòn vòlkanik. Rechèch yo te pwodwi anpil enterè sou deseni ki sot pase yo pou omwen de rezon. Premyèman, nou ka aprann nan men yo, pou egzanp, ki jan tèmofil 5, 6, anzim 7, 8 ak manbràn 9 yo estab nan tanperati ki wo konsa, oswa ki jan tèrmofil yo ka kenbe tèt ak nivo ekstrèm nan radyasyon10. Dezyèmman, yo se baz pou anpil aplikasyon biotechnologique enpòtan1,11,12 tankou pwodiksyon gaz13,14,15,16, sentèz chimik (dihydro, alkòl, metàn, asid amine, elatriye)17, biomining18 ak biocatalysts thermostable7,11, 13. An patikilye, reyaksyon chèn polymerase (PCR)19 ki byen koni kounye a enplike yon anzim (Taq polymerase) izole nan bakteri thermophilic Thermus aquaticus, youn nan premye tèrmofil yo dwe dekouvri.
Sepandan, etid la nan tèrmofil se pa yon travay fasil epi yo pa ka enpwovize nan nenpòt laboratwa byolojik. An patikilye, tèrmofil k ap viv yo pa ka obsève an vitro ak nenpòt mikwoskòp limyè estanda, menm ak chanm chofaj ki disponib nan komès, anjeneral rated pou tanperati osi ba ke 40 ° C. Depi ane 1990 yo, se sèlman kèk gwoup rechèch ki dedye tèt yo nan entwodiksyon de sistèm mikwoskospi wo tanperati (HTM). An 1994 Glukh et al. Chanm chofaj/refwadisman an te vin ansent baze sou itilizasyon yon selil Peltier ki kontwole tanperati kapilè rektangilè fèmen pou kenbe anaerobisite 20 . Aparèy la ka chofe jiska 100 °C nan yon vitès 2 °C/s, sa ki pèmèt otè yo etidye mobilite nan bakteri ipètermofil Thermotoga maritima21. An 1999 Horn et al. Yo te devlope yon aparèy ki sanble anpil, toujou baze sou itilizasyon kapilè chofe ki apwopriye pou mikwoskospi komèsyal pou etidye divizyon/koneksyon selilè. Apre yon peryòd tan nan inaktivite relatif, rechèch la pou HTMs efikas rekòmanse nan 2012, an patikilye an koneksyon avèk yon seri de papye pa gwoup la Wirth ki te itilize yon aparèy envante pa Horn et al. Kenz ane de sa, mobilite yon gwo kantite archaea, ki gen ladan hyperthermophiles, te etidye nan tanperati jiska 100 ° C lè l sèvi avèk kapilè chofe23,24. Yo menm tou yo modifye mikwoskòp orijinal la pou reyalize pi vit chofaj (plizyè minit olye pou yo 35 minit pou rive nan tanperati a mete) epi reyalize yon gradyan tanperati lineyè ki gen plis pase 2 cm atravè mwayen an. Sa a tanperati gradyan mete aparèy (TGFD) yo te itilize yo etidye mobilite nan anpil tèrmofil nan gradyan tanperati nan distans byolojik ki enpòtan 24, 25.
Chofaj kapilè fèmen se pa sèl fason pou obsève tèmofil vivan. Nan 2012, Kuwabara et al. Endijèn jetab chanm Pyrex sele ak adezif ki reziste chalè (Super X2; Cemedine, Japon) yo te itilize. Echantiyon yo te mete sou yon plak chofaj transparan ki disponib nan komès (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japon) ki kapab chofe jiska 110 ° C, men se pa orijinal ki fèt pou bioimaging. Otè yo obsève divizyon efikas nan bakteri tèrmofil anaerobik (Thermosipho globiformans, tan double 24 min) nan 65 ° C. Nan 2020, Pulshen et al. Chofaj efikas nan asyèt metal komèsyal yo (AttofluorTM, Thermofisher) te demontre lè l sèvi avèk de eleman chofaj endijèn: yon kouvèti ak yon etap (PCR machin-enspire konfigirasyon). Asosyasyon sa a rezilta nan yon tanperati likid inifòm ak anpeche evaporasyon ak kondansasyon nan pati anba a nan kouvèti a. Itilizasyon yon bag O evite echanj gaz ak anviwònman an. HTM sa a, ki rele Sulfoscope, te itilize pou imaj Sulfolobus acidocaldarius nan 75°C27.
Yon limit rekonèt nan tout sistèm sa yo se te restriksyon nan itilize nan objektif lè, nenpòt imèsyon lwil oliv yo pa apwopriye pou tanperati sa yo wo ak pou D 'nan > 1-mm epè echantiyon transparan. Yon limit rekonèt nan tout sistèm sa yo se te restriksyon nan itilize nan objektif lè, nenpòt imèsyon lwil oliv yo pa apwopriye pou tanperati sa yo wo ak pou D 'nan > 1-mm epè echantiyon transparan. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование возование востем было ограничение ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и зало подходило зрачные образцы толщиной > 1 мм. Yon enpèfeksyon rekonèt nan tout sistèm sa yo se te limit nan itilize nan objektif lè, depi nenpòt imèsyon lwil oliv pa t 'apwopriye pou tanperati sa yo wo ak pou vizyalizasyon nan echantiyon transparan > 1 mm epè.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适吘都不适吘濙适合气物镜，任何油浸都不适吘濙适合濙适合气物镜，毫米厚的透明样品成像。 Yon limit rekonèt nan tout sistèm sa yo se limit nan sèvi ak yon glas ki antre nan lè a, kòm nenpòt imèsyon lwil oliv pa apwopriye pou D echantiyon transparan > 1 mm epè nan tanperati sa yo wo. Ощепризнанныы ружение васivè Yon dezavantaj rekonèt nan tout sistèm sa yo se itilizasyon limite nan lantiy lè, nenpòt imèsyon lwil oliv pa apwopriye pou tanperati sa yo wo ak vizyalizasyon atravè echantiyon transparan > 1 mm epè.Plis dènyèman, limit sa a te leve pa Charles-Orzag et al. 28, ki te devlope yon aparèy ki pa gen okenn ankò bay chalè alantou sistèm nan enterè, men pito andedan glas la kouvèti tèt li, ki kouvri ak yon kouch mens transparan nan yon rezistans ki fèt ak ITO (indyòm-fèblan oksid). Kouvèti a ka chofe jiska 75 °C lè w pase yon kouran elektrik nan kouch transparan an. Sepandan, otè a dwe tou chofe lantiy la nan objektif la, men pa plis pase 65 °C, pou yo pa domaje li.
Travay sa yo montre ke devlopman efikas segondè-tanperati mikwoskospi optik pa te lajman adopte, souvan mande pou ekipman endijèn, epi li se souvan reyalize nan pri a nan rezolisyon espasyal, ki se yon dezavantaj grav bay mikwo-òganis tèrmofil yo pa pi gwo pase kèk. mikromèt. Redwi volim chofaj se kle nan rezoud twa pwoblèm nannan nan HTM: pòv rezolisyon espasyal, gwo inèsi tèmik lè sistèm nan chofe, ak chofaj danjere nan eleman ki antoure (lwil oliv imèsyon, lantiy objektif ... oswa men itilizatè) nan tanperati ekstrèm. ).
Nan papye sa a, nou prezante yon HTM pou obsèvasyon tèrmofil ki pa baze sou chofaj rezistan. Olye de sa, nou reyalize chofaj lokalize nan yon rejyon limite nan jaden mikwoskòp la nan vi nan iradyasyon lazè nan yon substra limyè-absòbe. Distribisyon tanperati a te vizyalize lè l sèvi avèk mikwoskopi faz quantitative (QPM). Efikasite metòd sa a demontre pa Geobacillus stearothermophilus, yon bakteri tèrmofil mobil ki repwodui nan apeprè 65 ° C epi ki gen yon tan doub (apeprè 20 minit), ak Sulfolobus shibatae, yon ipètermofil ki grandi nan yon tanperati ki pi bon nan 80 ° C (archaea) pou ilistre. Yo te obsève pousantaj replikasyon nòmal ak naje kòm yon fonksyon tanperati. Sa a lazè HTM (LA-HTM) pa limite pa epesè kouvèti a oswa pa nati objektif la (lè oswa imèsyon lwil oliv). Sa a pèmèt nenpòt lantiy rezolisyon segondè sou mache a yo dwe itilize. Li tou pa soufri nan chofaj ralanti akòz inèsi tèmik (reyalize chofaj enstantane sou yon echèl milisgond) epi li itilize sèlman konpozan ki disponib nan komès. Sèl enkyetid nouvo sekirite yo gen rapò ak prezans reyon lazè pwisan (tipikman jiska 100 mW) andedan aparèy la epi pètèt nan je yo, ki mande pou linèt pwoteksyon.
Prensip LA-HTM se sèvi ak yon lazè pou chofe echantiyon an lokalman nan jaden mikwoskòp la (figi 1a). Pou fè sa, echantiyon an dwe absòbe limyè. Pou sèvi ak yon pouvwa lazè rezonab (mwens pase 100 mW), nou pa t 'repoze sou absòpsyon nan limyè pa mwayen likid la, men atifisyèlman ogmante absòpsyon nan echantiyon an pa kouch substra a ak nanopartikul lò (figi 1c). Chofaj nanopartikul lò ak limyè se yon enpòtans fondamantal nan jaden an nan plasmonik tèmik, ak aplikasyon espere nan byomedsin, nanochimik oswa rekòlte limyè solèy la29,30,31. Pandan kèk ane ki sot pase yo, nou te itilize LA-HTM sa a nan plizyè etid ki gen rapò ak aplikasyon pou plasma tèmik nan fizik, chimi ak byoloji. Difikilte prensipal la ak metòd sa a se nan montre pwofil tanperati final la, depi tanperati ki wo a limite a yon rejyon mikwoskal nan echantiyon an. Nou te montre ke kat tanperati ka reyalize ak entèferomètr taye transverse kat longèdonn, yon metòd senp, wo-rezolisyon, ak trè sansib nan mikwoskòp faz quantitative ki baze sou itilizasyon griyaj diffraction ki genyen de dimansyon (ki rele tou griyaj kwa) 33,34,35,36. Te fyab nan teknik mikwoskòp tèmik sa a, ki baze sou mikwoskopi kwaze griyaj wavefront (CGM), yo te demontre nan yon douzèn papye pibliye sou deseni ki sot pase a37,38,39,40,41,42,43.
Plan enstalasyon paralèl lazè chofaj, fòme ak mikwoskòp tanperati. b Egzanp jeyometri ki fòme ak yon chanm AttofluorTM ki gen yon lam ki kouvri ak nanopartikil lò. c Gade echantiyon an ak anpil atansyon (pa echèl). d reprezante pwofil travès lazè inifòm ak (e) distribisyon tanperati ki fèt aprè simulation sou plan echantiyon nan nanopartikul lò yo. f se yon pwofil reyon lazè annulaire apwopriye pou jenere yon tanperati inifòm jan yo montre nan simulation distribisyon tanperati ki lakòz yo montre nan (g). Ba echèl: 30 µm.
An patikilye, nou dènyèman reyalize chofaj selil mamifè ak LA-HTM ak CGM ak swiv repons selilè chòk chalè nan seri a nan 37-42 ° C, demontre aplikabilite nan teknik sa a nan imaj selil vivan sèl. Sepandan, aplikasyon LA-HTM nan etid mikwo-òganis nan tanperati ki wo se pa klè, paske li mande plis prekosyon konpare ak selil mamifè yo: premyèman, chofaj anba mwayen an pa dè dizèn de degre (olye ke kèk degre) mennen. nan yon gradyan tanperati vètikal fò. ka kreye likid konveksyon 44 ki, si li pa byen tache ak substra a, ka lakòz mouvman endezirab ak melanje nan bakteri. Ka konveksyon sa a dwe elimine pa diminye epesè kouch likid la. Pou rezon sa a, nan tout eksperyans yo prezante anba a, yo te mete sispansyon bakteri ant de kouvèti ki gen apeprè 15 µm epè ki mete andedan yon gode metal (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Nan prensip, konveksyon ka evite si epesè likid la pi piti pase gwosè gwo bout bwa lazè chofaj la. Dezyèmman, travay nan yon jeyometri limite konsa ka toufe òganis aerobic (gade Fig. S2). Pwoblèm sa a ka evite lè w sèvi ak yon substra ki pèmeyab ak oksijèn (oswa nenpòt lòt gaz enpòtan), lè w kite bul lè kwense andedan lam kouvèti a, oswa lè w fè twou nan lam kouvèti anwo a (gade Fig. S1) 45 . Nan etid sa a, nou te chwazi dènye solisyon an (Figi 1b ak S1). Finalman, chofaj lazè pa bay distribisyon tanperati inifòm. Menm nan menm entansite gwo bout bwa lazè a (Fig. 1d), distribisyon tanperati a pa inifòm, men pito sanble ak distribisyon Gaussian akòz difizyon tèmik (Fig. 1e). Lè objektif la se etabli tanperati egzak nan jaden an de vi pou etidye sistèm byolojik, pwofil inegal yo pa ideyal epi yo ka mennen tou nan mouvman tèrmoforetik nan bakteri si yo pa konfòme yo ak substra a (al gade Fig. S3, S4)39. Pou sa ka fèt, nou te itilize yon modulator limyè espasyal (SLM) pou fòme reyon lazè enfrawouj la dapre fòm bag la (figi 1f) nan plan echantiyon an pou reyalize yon distribisyon tanperati parfe inifòm nan yon zòn jeyometrik bay, malgre difizyon tèmik (Fig. 1d) 39, 42, 46. Mete yon kouvèti anlè sou yon plat metal (Figi 1b) pou evite evaporasyon mwayen an epi obsève pou omwen kèk jou. Paske kouvèti tèt sa a pa sele, mwayen adisyonèl ka fasil pou ajoute nenpòt ki lè si sa nesesè.
Pou ilistre kouman LA-HTM travay epi demontre aplikasyon li nan rechèch tèrmofil, nou etidye bakteri aerobic Geobacillus stearothermophilus, ki gen yon tanperati pi gwo kwasans anviwon 60-65 ° C. Bakteri a tou gen flagèl ak kapasite nan naje, bay yon lòt endikatè nan aktivite nòmal selilè.
Echantiyon yo (figi 1b) yo te pre-enkube nan 60 ° C pou yon èdtan epi yo mete yo nan yon detantè echantiyon LA-HTM. Pre-enkubasyon sa a opsyonèl, men li toujou itil, pou de rezon: Premyèman, lè lazè a limen, li lakòz selil yo grandi epi divize imedyatman (gade fim M1 nan Materyèl siplemantè). San yo pa pre-enkubasyon, kwasans bakteri anjeneral retade apeprè 40 minit chak fwa yo chofe yon nouvo zòn gade sou echantiyon an. Dezyèmman, 1 èdtan pre-enkubasyon ankouraje adezyon bakteri yo nan kouvèti a, anpeche selil yo soti nan jaden an de vi akòz tèrmoforèz lè lazè a te limen (al gade fim M2 nan Materyèl siplemantè). Thermophoresis se mouvman nan patikil oswa molekil sou yon gradyan tanperati, anjeneral, soti nan cho rive frèt, ak bakteri pa gen okenn eksepsyon43,47. Efè endezirab sa a elimine sou yon zòn bay lè l sèvi avèk SLM pou fòme reyon lazè a epi reyalize yon distribisyon tanperati plat.
Sou fig. Figi 2 montre distribisyon tanperati a mezire pa CGM ki te jwenn nan iradyasyon yon substra vè kouvwi ak nanopartikil lò ak yon gwo bout bwa lazè annulaire (Fig. 1f). Yo te obsève yon distribisyon tanperati plat sou tout zòn ki kouvri pa reyon lazè a. Zòn sa a te fikse a 65 ° C, tanperati kwasans optimal. Deyò rejyon sa a, koub tanperati a natirèlman tonbe nan \(1/r\) (kote \(r\) se kowòdone radial la).
yon kat Tanperati mezi CGM yo te jwenn lè w itilize yon reyon lazè annulaire pou iradyasyon yon kouch nanopartikil lò pou jwenn yon pwofil tanperati plat sou yon zòn sikilè. b Izotèm kat tanperati a (a). Se kontou a nan gwo bout bwa a lazè reprezante pa yon sèk gri pwentiye. Eksperyans lan te repete de fwa (gade Materyèl siplemantè, Figi S4).
Yo te kontwole viabilite selil bakteri pandan plizyè èdtan lè l sèvi avèk LA-HTM. Sou fig. 3 montre entèval tan pou kat imaj yo pran nan yon fim 3 èdtan 20 minit (Fim M3, Enfòmasyon Siplemantè). Yo te obsève bakteri yo aktivman pwopagasyon nan zòn sikilè defini pa lazè a kote tanperati a te pi bon, apwoche 65 ° C. Kontrèman, kwasans selil yo te siyifikativman redwi lè tanperati a te tonbe anba 50 ° C pou 10 s.
Imaj pwofondè optik nan bakteri G. stearothermophilus k ap grandi apre chofaj lazè nan diferan moman, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, soti nan 200 Ekstrè nan yon fim yon minit (fim M3 yo bay nan Enfòmasyon siplemantè) sipèpoze sou kat tanperati ki koresponn lan. Lazè a limen nan moman \(t=0\). Izotèm yo te ajoute nan imaj la entansite.
Pou plis quantifier kwasans selil ak depandans li sou tanperati a, nou mezire ogmantasyon nan byomass nan plizyè koloni bakteri okòmansman izole nan fim nan M3 jaden de vi (Fig. 4). Nan Figi S6, yo montre bakteri paran yo chwazi nan kòmansman fòmasyon inite ki fòme mini koloni (mCFU). Mezi mas sèk yo te pran ak yon kamera CGM 48 ki te itilize pou kat distribisyon tanperati a. Kapasite CGM pou mezire pwa sèk ak tanperati se fòs LA-HTM. Kòm espere, tanperati ki wo te lakòz kwasans bakteri pi vit (figi 4a). Jan yo montre nan trase semi-log nan Fig. 4b, kwasans nan tout tanperati swiv kwasans eksponansyèl, kote done yo itilize fonksyon eksponansyèl \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kote \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) - tan jenerasyon (oswa tan double), \( g =1/ \tau\) - to kwasans (kantite divizyon pou chak inite tan). Sou fig. 4c montre to kwasans respektif ak tan jenerasyon an kòm yon fonksyon tanperati. MCFU k ap grandi rapid yo karakterize pa saturation kwasans apre de zè de tan, yon konpòtman espere akòz gwo dansite bakteri (menm jan ak faz nan estasyonè nan kilti likid klasik). Fòm jeneral \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) koresponn ak koub de-faz espere pou G. stearothermophilus ak yon to kwasans optimal alantou 60-65 °C. Koresponn ak done yo lè l sèvi avèk yon modèl kadinal (Figi S5)49 kote \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, ki byen dakò ak lòt valè yo site nan literati a49. Malgre ke paramèt depandan tanperati yo repwodiktif, to kwasans maksimòm \({G}_{0}\) ka varye de yon eksperyans nan yon lòt (gade figi S7-S9 ak fim M4). Kontrèman ak paramèt tanperati Fitting, ki ta dwe inivèsèl, to kwasans maksimòm lan depann de pwopriyete mwayen an (disponiblite eleman nitritif, konsantrasyon oksijèn) nan jeyometri mikwoskal yo obsève.
a Kwasans mikwòb nan divès tanperati. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Done yo jwenn nan yon videyo sou yon sèl bakteri k ap grandi nan yon gradyan tanperati (fim M3). b Menm jan ak (a), echèl semi-logaritmik. c To kwasans\(\tau\) ak tan jenerasyon\(g\) kalkile apati regression lineyè (b). Ba erè orizontal: ranje tanperati sou ki mCFU yo te elaji nan jaden an de vi pandan kwasans lan. Vètikal erè ba: lineyè estanda erè.
Anplis de sa nan kwasans nòmal, kèk bakteri pafwa flote nan vi pandan chofaj lazè, ki se yon konpòtman espere pou bakteri ki gen flagèl. Fim nan M5 nan enfòmasyon adisyonèl montre aktivite naje sa yo. Nan eksperyans sa a, yo te itilize radyasyon lazè inifòm pou kreye yon gradyan tanperati, jan yo montre nan Figi 1d, e ak S3. Figi 5 montre de sekans imaj yo chwazi nan fim M5 ki montre ke yon bakteri montre mouvman direksyon pandan tout lòt bakteri rete san mouvman.
De tan yo (a) ak (b) montre naje de bakteri diferan ki make ak ti sèk pwentiye yo. Imaj yo te ekstrè nan fim nan M5 (bay kòm materyèl siplemantè).
Nan ka G. stearothermophilus, mouvman aktif bakteri (figi 5) te kòmanse kèk segonn apre yo te limen reyon lazè a. Obsèvasyon sa a mete aksan sou repons tanporèl mikwo-òganis tèrmofil sa a nan yon ogmantasyon nan tanperati, jan Mora et al. 24 . Sijè a nan mobilite bakteri ak menm thermotaxis ka plis eksplore lè l sèvi avèk LA-HTM.
Naje mikwòb pa ta dwe konfonn ak lòt kalite mouvman fizik, sètadi (i) mouvman Brownian, ki sanble se mouvman chaotic ki pa gen okenn direksyon defini, (ii) konveksyon 50 ak tèrmoforèz 43, ki fòme ak yon mouvman regilye nan yon tanperati. gradyan.
G. stearothermophilus se li te ye pou kapasite li nan pwodwi espò trè rezistan (fòmasyon spor) lè ekspoze a kondisyon anviwònman negatif kòm yon defans. Lè kondisyon anviwònman an vin favorab ankò, espò yo jèmen, fòme selil k ap viv ak rekòmanse kwasans. Malgre ke pwosesis sporulation / jèminasyon sa a byen li te ye, li pa janm te obsève an tan reyèl. Sèvi ak LA-HTM, nou rapòte isit la premye obsèvasyon nan evènman jèminasyon nan G. stearothermophilus.
Sou fig. 6a montre imaj time-lapse nan pwofondè optik (OT) jwenn lè l sèvi avèk yon seri CGM nan 13 espò. Pou tout tan koleksyon an (15 h 6 min, \(t=0\) - kòmansman chofaj lazè), 4 sou 13 espò jèmen, nan pwen tan siksesif \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ak \(11\) h \(30\)'. Malgre ke se sèlman youn nan evènman sa yo montre nan Figi 6, 4 evènman jèminasyon ka obsève nan fim nan M6 nan materyèl siplemantè a. Enteresan, jèminasyon parèt o aza: se pa tout espò jèmen epi yo pa jèmen an menm tan, malgre menm chanjman yo nan kondisyon anviwònman an.
a Time-lapse ki gen 8 imaj OT (imèsyon lwil oliv, 60x, 1.25 NA objektif) ak (b) evolisyon byomass nan G. stearothermophilus total. c (b) Trase sou yon echèl semi-boutik pou mete aksan sou lineyè to kwasans lan (liy tirè).
Sou fig. 6b,c montre byomass popilasyon selil yo nan chan de vi a kòm yon fonksyon tan pandan tout peryòd koleksyon done yo. Dekonpozisyon rapid mas sèk la obsève nan \(t=5\)h nan fig. 6b, c, akòz sòti nan kèk selil ki soti nan jaden an de vi. To kwasans kat evènman sa yo se \(0.77\pm 0.1\) h-1. Valè sa a pi wo pase to kwasans ki asosye ak Figi 3. 3 ak 4, kote selil yo grandi nòmalman. Rezon ki fè ogmantasyon pousantaj kwasans G. stearothermophilus soti nan espò yo pa klè, men mezi sa yo mete aksan sou enterè LA-HTM ak travay nan nivo sèl selil (oswa nan nivo mCFU sèl) pou aprann plis sou dinamik lavi selil. .
Pou plis demontre adaptabilite nan LA-HTM ak pèfòmans li nan tanperati ki wo, nou egzamine kwasans lan nan Sulfolobus shibatae, yon archaea acidofil hyperthermophilic ak yon tanperati kwasans pi gwo nan 80 ° C51. Konpare ak G. stearothermophilus, archaea sa yo tou gen yon mòfoloji trè diferan, ki sanble ak 1 mikron esfè (kok) olye ke baton long (bazil).
Figi 7a konsiste de imaj pwofondè optik sekans nan S. shibatae mCFU jwenn lè l sèvi avèk CGM (gade fim karakteristik M7 nan Materyèl siplemantè). mCFU sa a ap grandi nan anviwon 73 ° C, anba tanperati pi gwo a nan 80 ° C, men nan seri tanperati a pou kwasans aktif. Nou te obsève plizyè evènman fisyon ki te fè mCFU yo sanble ak mikwo rezen archaea apre kèk èdtan. Soti nan imaj OT sa yo, yo te mezire byomass mCFU sou tan ak prezante nan Figi 7b. Enteresan, S. shibatae mCFUs te montre lineyè kwasans olye ke kwasans eksponansyèl yo te wè ak G. stearothermophilus mCFUs. Gen yon diskisyon ki dire lontan 52 sou nati pousantaj kwasans selil yo: pandan ke kèk etid rapòte to kwasans mikwòb ki pwopòsyonèl ak gwosè yo (kwasans eksponansyèl), lòt moun montre yon to konstan (kwasans lineyè oswa bilineè). Jan Tzur et al.53 eksplike sa, fè distenksyon ant kwasans eksponansyèl ak (bi)lineyè mande pou yon presizyon <6% nan mezi byomass, ki pa rive jwenn pou pifò teknik QPM, menm ki enplike entèferometri. Jan Tzur et al.53 eksplike sa, fè distenksyon ant kwasans eksponansyèl ak (bi)lineyè mande pou yon presizyon <6% nan mezi byomass, ki pa rive jwenn pou pifò teknik QPM, menm ki enplike entèferometri. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста треного роста треточ но 6% х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерфериромассы. Jan Zur et al.53 eksplike sa, fè distenksyon ant kwasans eksponansyèl ak (bi)lineyè mande pou <6% presizyon nan mezi byomass, ki pa ka reyalize pou pifò metòd QPM, menm lè l sèvi avèk entèferometri.Jan yo eksplike sa Zur et al. 53, fè distenksyon ant kwasans eksponansyèl ak (bi)lineyè mande pou mwens pase 6% presizyon nan mezi byomass, ki pa ka reyalize pou pifò metòd QPM, menm lè yo itilize entèferometri. CGM reyalize presizyon sa a ak presizyon sub-pg nan mezi byomass36,48.
a Time-lapse ki gen 6 imaj OT (imèsyon lwil oliv, 60x, NA objektif 1.25) ak (b) evolisyon biomass mikwo-CFU mezire ak CGM. Gade fim M7 pou plis enfòmasyon.
Kwasans parfe lineyè S. shibatae te inatandi e li poko rapòte. Sepandan, yo espere kwasans eksponansyèl, omwen paske avèk yon tan, plizyè divizyon 2, 4, 8, 16 ... selil yo dwe rive. Nou te ipotèz ke kwasans lineyè ta ka akòz anpèchman selil akòz anbalaj selil dans, menm jan kwasans selil ralanti epi evantyèlman rive nan yon eta andòmi lè dansite selil la twò wo.
Nou konkli nan diskite sou senk pwen sa yo nan enterè nan vire: rediksyon nan volim chofaj, rediksyon nan inèsi tèmik, enterè nan nanopartikil lò, enterè nan mikwoskospi faz quantitative, ak yon seri tanperati posib nan ki LA-HTM ka itilize.
Konpare ak chofaj rezistan, chofaj lazè yo itilize pou devlopman HTM ofri plizyè avantaj, ke nou ilistre nan etid sa a. An patikilye, nan medya likid nan jaden an de vi nan mikwoskòp la, se volim nan chofaj kenbe nan yon kèk (10 μm) 3 komèsan. Nan fason sa a, sèlman mikwòb yo obsève yo aktif, pandan y ap lòt bakteri yo andòmi epi yo ka itilize plis etid echantiyon an - pa gen okenn bezwen chanje echantiyon an chak fwa yon nouvo tanperati bezwen tcheke. Anplis de sa, chofaj mikwoskal pèmèt egzamen dirèk nan yon seri gwo tanperati: Figi 4c te jwenn nan yon fim 3 èdtan (Fim M3), ki anjeneral mande pou preparasyon an ak egzamen plizyè echantiyon - youn pou chak nan echantiyon yo anba etid. y se tanperati ki reprezante kantite jou nan eksperyans la. Diminye volim nan chofe tou kenbe tout konpozan optik ki antoure nan mikwoskòp la, espesyalman lantiy la objektif, nan tanperati chanm, ki te yon gwo pwoblèm nan kominote a fè fas a twò lwen. LA-HTM ka itilize ak nenpòt lantiy, ki gen ladan lantiy imèsyon lwil oliv, epi yo pral rete nan tanperati chanm nan menm ak tanperati ekstrèm nan jaden an de vi. Limit prensipal la nan metòd la chofaj lazè ke nou rapòte nan etid sa a se ke selil ki pa respekte oswa flote ka byen lwen soti nan jaden an de vi ak difisil yo etidye. Yon solisyon ta ka sèvi ak lantiy agrandisman ki ba pou reyalize yon pi gwo ogmantasyon tanperati ki depase kèk santèn mikron. Prekosyon sa a akonpaye pa yon diminisyon nan rezolisyon espasyal, men si objektif la se etidye mouvman an nan mikwo-òganis, rezolisyon espasyal segondè pa obligatwa.
Echèl tan pou chofe (ak refwadi) sistèm nan \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depann de gwosè li, dapre lalwa \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kote \ (L\) se gwosè karakteristik sous chalè a (dyamèt reyon lazè a nan etid nou an se \(L\ apeprè 100\) μm), \(D\) se difizyon tèmik anviwònman an (mwayèn nan ka, vè ak dlo vitès difizyon\(D\ apeprè 2\pliye {10}^{-7}\) m2/s Se poutèt sa, nan etid sa a, repons tan nan lòd 50 ms, sa vle di, kazi-enstantane). Chanjman tanperati, yo ka espere etablisman enstantane nan ogmantasyon tanperati a pa sèlman diminye dire eksperyans la, men tou, pèmèt tan egzak \(t=0\) pou nenpòt etid dinamik nan efè tanperati.
Metòd pwopoze nou an aplikab a nenpòt substrate ki absòbe limyè (pa egzanp, echantiyon komèsyal ak kouch ITO). Sepandan, nanopartikul lò yo kapab bay absòpsyon segondè nan absòpsyon enfrawouj la ak ba nan seri a vizib, karakteristik sa yo lèt nan ki se nan enterè pou obsèvasyon optik efikas nan seri a vizib, espesyalman lè w ap itilize fluoresans. Anplis de sa, lò se biokonpatib, chimikman inaktif, dansite optik ka ajiste soti nan 530 nm nan tou pre enfrawouj, ak preparasyon echantiyon se senp ak ekonomik29.
Transverse griyaj mikwoskòp wavefront (CGM) pèmèt non sèlman kat tanperati nan mikwoskal la, men tou siveyans byomass, ki fè li patikilyèman itil (si li pa nesesè) nan konbinezon ak LA-HTM. Pandan deseni ki sot pase a, lòt teknik mikwoskospi tanperati yo te devlope, espesyalman nan jaden an nan byoimaj, ak pi fò nan yo mande pou yo sèvi ak sond fliyoresan tanperati-sansib54,55. Sepandan, metòd sa yo te kritike ak kèk rapò te mezire chanjman tanperati ireyèl nan selil yo, petèt akòz lefèt ke fliyoresans depann sou anpil faktè lòt pase tanperati. Anplis de sa, pi fò sond fliyoresan yo enstab nan tanperati ki wo. Se poutèt sa, QPM ak an patikilye CGM reprezante yon teknik mikwoskòp tanperati ideyal pou etidye lavi nan tanperati ki wo lè l sèvi avèk mikwoskòp optik.
Etid S. shibatae, ki viv optimal nan 80 ° C, montre ke LA-HTM ka aplike pou etidye hyperthermophiles, pa sèlman senp thermophiles. Nan prensip, pa gen okenn limit nan seri a nan tanperati ki ka rive nan lè l sèvi avèk LA-HTM, e menm tanperati ki pi wo a 100 ° C ka rive nan presyon atmosferik san yo pa bouyi, jan yo demontre pa gwoup nou an nan 38 nan aplikasyon chimi idrothermal nan atmosferik. presyon A. Yo itilize yon lazè pou chofe nanopartikul lò 40 nan menm fason an. Kidonk, LA-HTM gen potansyèl pou yo itilize pou obsève hyperthermophiles san parèy ak estanda mikwoskòp optik rezolisyon segondè nan kondisyon estanda (sa vle di anba estrès anviwònman).
Tout eksperyans yo te fèt lè l sèvi avèk yon mikwoskòp endijèn, ki gen ladan ekleraj Köhler (ak LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), detantè echantiyon ak mouvman manyèl xy, objektif (Olympus, 60x, 0.7 NA, lè, LUCPlanFLN60X oswa 60x, 1.25 NA, lwil oliv). , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI kwa griyaj, 39 µm anplasman, 0.87 mm soti nan Andor Zyla Capteur kamera) pou bay entansite ak D 'ond, ak kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mòd 16-bit, ki soti nan Hamamatsu) pou anrejistre a. done yo montre nan Figi 5 (naje bakteri). Splitter gwo bout bwa dichroic se yon kwen BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filtè sou devan kamera a se yon filtè 694 kout pas (FF02-694/SP-25, Semrock). Titàn safi lazè (Lazè Verdi G10, 532 nm, 10 W, ponpe kavite lazè tsunami, Spectra-Physics nan Fig. 2-5, plis ranplase pa Millenia lazè, Spectraphysics 10 W, ponpe kavite lazè Mira, Coherent, pou Fig. 2 -5). 6 ak 7) yo mete sou longèdonn \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, ki koresponn ak spectre sonorite plasmon nan nanopartikil lò. Modilatè limyè espasyal (1920 × 1152 piksèl) yo te achte nan men Meadowlark Optics yo te kalkile ologram yo avèk algorithm Gerchberg-Saxton jan sa dekri nan lyen an.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) se yon teknik mikwoskospi optik ki baze sou konbine yon griyaj difraksyon ki genyen de dimansyon (ke yo rele tou kwa griyaj) nan yon distans yon milimèt soti nan Capteur yon kamera konvansyonèl. Egzanp ki pi komen nan yon CGM ke nou te itilize nan etid sa a rele yon entèferomètr transverse shift kat-longè ond (QLSI), kote kwa-griyaj la konsiste de yon modèl entansite / faz entansite / faz prezante ak patante pa Primot et al. an 200034. Liy griyaj vètikal ak orizontal yo kreye lonbraj ki sanble ak kadriyaj sou Capteur a, distòsyon ki ka nimerikman trete an tan reyèl pou jwenn distòsyon optik wavefront (oswa pwofil faz ekivalan) nan limyè ensidan an. Lè yo itilize sou yon mikwoskòp, yon kamera CGM ka montre diferans nan chemen optik nan yon objè imaj, ke yo rele tou pwofondè optik (OT), ak yon sansiblite nan lòd nan nanomèt36. Nan nenpòt mezi CGM, yo nan lòd yo elimine nenpòt defo nan eleman yo optik oswa travès, yo dwe pran yon imaj prensipal referans OT ak soustraksyon nan nenpòt imaj ki vin apre yo.
Yo te fè mikwoskospi tanperati lè l sèvi avèk yon kamera CGM jan sa dekri nan referans la. 32. Nan ti bout tan, chofaj yon likid chanje endèks refraktif li yo, kreye yon efè lantiy tèmik ki defòme gwo bout bwa a ensidan. CGM a mezire distòsyon vag sa a epi trete lè l sèvi avèk yon algorithm dekonvolusyon pou jwenn yon distribisyon tanperati ki genyen twa dimansyon nan mwayen likid la. Si nanopartikul lò yo distribye respire nan tout echantiyon an, kat tanperati ka fèt nan zòn ki pa gen bakteri pou pwodwi pi bon imaj, ki se sa nou fè pafwa. Te referans CGM imaj la akeri san chofaj (ak lazè a koupe) epi imedyatman kaptire nan menm kote a nan imaj la ak lazè a sou.
Mezi mas sèk reyalize lè l sèvi avèk menm kamera CGM yo itilize pou D tanperati. Imaj referans CGM yo te jwenn pa rapidman deplase echantiyon an nan x ak y pandan ekspoze kòm yon mwayen pou mwayèn nenpòt inhomogeneity nan OT la akòz prezans nan bakteri. Soti nan imaj OT nan bakteri, byomass yo te jwenn lè l sèvi avèk yon ansanbl imaj sou zòn yo chwazi lè l sèvi avèk algorithm segman endijèn Matlab a (gade sou-seksyon "Kòd nimerik"), swiv pwosedi ki dekri nan ref. 48. An brèf, nou itilize relasyon \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kote \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) se imaj pwofondè optik la, \(m\) se pwa sèk la ak \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) se yon konstan. Nou te chwazi \({{{{\rm{\alpha})))))=0.18\) µm3/pg, ki se yon konstan tipik pou selil vivan yo.
Yo te mete yon kouvèti 25 mm an dyamèt ak 150 µm epè ki kouvri ak nanopartikil lò nan yon chanm AttofluorTM (Thermofisher) ak nanopartikil lò yo fè fas a anlè. Geobacillus stearothermophilus te precultured lannwit lan nan mwayen LB (200 rpm, 60 ° C) anvan chak jou nan eksperyans. Yon gout 5 µl nan yon sispansyon nan G. stearothermophilus ak yon dansite optik (OD) nan 0.3 a 0.5 te mete sou yon glise kouvèti ak nanopartikul lò. Lè sa a, yon glise kouvèti wonn 18 mm an dyamèt ak yon twou 5 mm an dyamèt nan sant la te tonbe sou gout la, ak 5 μl nan sispansyon bakteri ak menm dansite optik te repete aplike nan sant la nan twou a. Yo te prepare pwi yo sou kouvèti kouvèti an akò ak pwosedi ki dekri nan ref. 45 (gade Enfòmasyon Siplemantè pou plis enfòmasyon). Lè sa a, ajoute 1 ml mwayen LB nan kouvèti a pou anpeche kouch likid la seche. Dènye kouvèti a mete sou kouvèti fèmen chanm Attofluor™ pou anpeche evaporasyon mwayen an pandan enkubasyon. Pou eksperyans jèminasyon, nou te itilize espò, ki, apre eksperyans konvansyonèl yo, pafwa kouvri tèt kouvèti a. Yon metòd menm jan an te itilize pou jwenn Sulfolobus shibatae. Twa jou (200 rpm, 75 ° C) nan kiltivasyon preliminè nan Thiobacillus serrata te pote soti nan mwayen 182 (DSMZ).
Echantiyon nanopartikil lò yo te prepare pa litografi micellar kopolimèr blòk. Pwosesis sa a dekri an detay nan Chap. 60. Yon ti tan, yo te sentèz micelèl ki ankapsule iyon lò lè yo melanje copolymer la ak HAuCl4 nan toluèn. Lè sa a, kouvèti yo netwaye yo te benyen nan solisyon an epi trete ak iradyasyon UV nan prezans yon ajan rediksyon pou jwenn grenn lò. Finalman, grenn lò yo te grandi lè yo kontakte yon kouvèti ak yon solisyon akeuz nan KAuCl4 ak etanolamin pou 16 minit, ki te lakòz yon aranjman kazi-periyodik ak trè inifòm nan nanopartikul lò ki pa esferik nan tou pre enfrawouj la.
Pou konvèti entèferogram yo nan imaj OT, nou te itilize yon algorithm endijèn, jan yo detaye nan lyen an. 33 epi li disponib kòm yon pake Matlab nan depo piblik sa a: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pake a ka kalkile entansite ak imaj OT ki baze sou entèferogram anrejistre (ki gen ladan imaj referans) ak distans etalaj kamera.
Pou kalkile modèl faz aplike nan SLM pou jwenn yon pwofil tanperati yo bay, nou te itilize yon algorithm endijèn ki te devlope deja39,42 ki disponib nan depo piblik sa a: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Antre a se jaden tanperati a vle, ki ka mete nimerik oswa atravè yon imaj bmp kamayeu.
Pou segmante selil yo epi mezire pwa sèk yo, nou itilize algorithm Matlab nou an ki te pibliye nan depo piblik sa a: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Sou chak imaj, itilizatè a dwe klike sou bakteri oswa mCFU ki enterese, ajiste sansiblite ralonj la, epi konfime seleksyon an.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid, gade abstrè Rapò rechèch la nati ki lye nan atik sa a.
Done ki sipòte rezilta etid sa a disponib nan men otè respektif yo sou demann rezonab.
Kòd sous yo itilize nan etid sa a detaye nan seksyon Metòd, epi vèsyon debug yo ka telechaje nan https://github.com/baffou/ nan depo sa yo: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, ak CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight nan thermophiles ak aplikasyon yo lajè-spectre. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight nan thermophiles ak aplikasyon yo lajè-spectre.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ak Sharma, AK Apèsi sou tèrmofil ak aplikasyon lajè yo. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ak Sharma AK Yon konpreyansyon pwofon sou tèmofil ak yon pakèt aplikasyon.3 Biotechnologie 6, 81 (2016).
Tan pòs: 26 septanm 2022