Maladi alzayme a (AD) manke biomarqueurs pwoteyin ki reflete miltip fizyoloji kache li yo, ki anpeche pwogrè nan dyagnostik ak tretman. Isit la, nou itilize pwoteomik konplè pou idantifye byomarkè likid serebrospinal (CSF) ki reprezante yon pakèt fizyoloji AD. Spectrometri mas multiplex idantifye apeprè 3,500 ak apeprè 12,000 pwoteyin nan AD CSF ak sèvo a, respektivman. Analiz rezo pwoteòm sèvo a te rezoud 44 modil divèsite biyolojik, 15 ladan yo sipèpoze ak pwoteòm likid serebrospinal la. Makè AD CSF yo nan modil sipèpoze sa yo pliye nan senk gwoup pwoteyin, ki reprezante diferan pwosesis fizyolojik. Sinaps yo ak metabolit nan sèvo AD diminye, men CSF la ogmante, pandan y ap myelination ki rich ak glial ak gwoup iminitè nan sèvo a ak CSF ogmante. Konsistans ak espesifik maladi chanjman panèl yo te konfime nan plis pase 500 echantiyon CSF adisyonèl. Gwoup sa yo te idantifye tou sougwoup byolojik nan AD san sentòm. An jeneral, rezilta sa yo se yon etap pwomèt nan direksyon pou zouti biomarker ki baze sou entènèt pou aplikasyon klinik nan AD.
Maladi alzayme a (AD) se kòz ki pi komen nan demans neurodegenerative atravè lemond e li karakterize pa yon pakèt disfonksyon sistèm byolojik, ki gen ladan transmisyon sinaptik, iminite glial-medyatè, ak metabolis mitokondriyo (1-3). Sepandan, biomarkers pwoteyin etabli li yo toujou konsantre sou detekte amiloid ak pwoteyin tau, ak Se poutèt sa pa ka reflete divès fizyoloji sa a. Biomarkers pwoteyin "debaz" sa yo ki pi fyab mezire nan likid serebrospinal (CSF) gen ladan (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), ki reflete fòmasyon nan plak amiloid cortical; (ii) total tau, yon siy dejenerasyon axon; (iii) fosfo-tau (p-tau), yon reprezantan nan hyperphosphorylation tau patolojik (4-7). Malgre ke byomarkè likid serebrospinal sa yo te fasilite deteksyon nou an nan "make" maladi pwoteyin AD (4-7), yo reprezante sèlman yon ti pati nan byoloji konplèks ki dèyè maladi a.
Mank divèsite fizyolojik nan byomarkè AD te mennen nan anpil defi, ki gen ladan (i) enkapasite pou idantifye ak quantifier eterojenite byolojik pasyan AD, (ii) mezi ensifizan nan severite maladi ak pwogresyon, espesyalman nan etap preklinik la, Ak ( iii) devlopman nan dwòg terapetik ki echwe pou pou rezoud konplètman tout aspè nan deteryorasyon newolojik. Depandans nou sou patoloji bòn tè pou dekri AD ki soti nan maladi ki gen rapò sèlman agrave pwoblèm sa yo. Plis ak plis prèv montre ke pifò granmoun aje ki gen demans gen plis pase yon karakteristik patolojik nan n bès mantal (8). Otan ke 90% oswa plis nan moun ki gen patoloji AD tou gen maladi vaskilè, enklizyon TDP-43, oswa lòt maladi dejeneratif (9). Gwo pwopòsyon sa yo nan sipèpoze patolojik te deranje fondasyon dyagnostik aktyèl nou an pou demans, epi li nesesè yon definisyon fizyolojik pi konplè sou maladi a.
Nan sans de bezwen an ijan pou yon varyete de byomaketè AD, jaden an ap de pli zan pli adopte "omics" metòd la ki baze sou sistèm an jeneral yo dekouvri biomaketè. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance te lanse an 2014 epi li se nan forefront nan pwogram nan. Efò miltidisiplinè sa a pa Enstiti Nasyonal Sante, akademi, ak endistri gen pou objaktif pou sèvi ak estrateji ki baze sou sistèm yo pi byen defini fizyoloji nan AD epi devlope analiz dyagnostik divèsite biyolojik ak estrateji tretman (10). Kòm yon pati nan pwojè sa a, rezo pwoteomik te vin tounen yon zouti pwomèt pou avansman nan byomarkè ki baze sou sistèm nan AD. Apwòch san patipri ki baze sou done sa a òganize seri done pwoteomik konplèks an gwoup oswa "modil" nan pwoteyin ko-eksprime ki asosye ak kalite selil espesifik, òganèl, ak fonksyon byolojik (11-13). Prèske 12 etid pwoteomik rezo enfòmasyon ki rich yo te fèt sou sèvo AD (13-23). An jeneral, analiz sa yo endike ke pwoteòm rezo sèvo AD kenbe yon òganizasyon modilè trè konsève nan kowòt endepandan ak plizyè rejyon cortical. Anplis de sa, kèk nan modil sa yo montre chanjman repwodiktif nan abondans ki gen rapò ak AD atravè seri done, ki reflete fizyopatoloji a nan plizyè maladi. Kolektivman, rezilta sa yo demontre yon pwen jete lank pwomèt pou dekouvèt pwoteòm rezo sèvo a kòm yon byomarkè ki baze sou sistèm nan AD.
Yo nan lòd yo transfòme pwoteòm rezo sèvo AD nan biomaketè ki baze sou sistèm nan klinik itil, nou konbine rezo ki sòti nan sèvo a ak analiz pwoteomik AD CSF. Apwòch entegre sa a te mennen nan idantifikasyon senk seri pwomèt CSF byomarkè ki asosye ak yon pakèt domèn fizyopatoloji ki baze sou sèvo, ki gen ladan sinaps, veso sangen, myelination, enflamasyon, ak malfonksyònman nan chemen metabolik yo. Nou valide avèk siksè panno biomakè sa yo atravè plizyè analiz replikasyon, ki gen ladan plis pase 500 echantiyon CSF ki soti nan divès maladi neurodegenerative. Analiz validation sa yo enkli egzamine sib gwoup nan CSF pasyan ki gen AD asymptomatik (AsymAD) oswa montre prèv akimilasyon amiloid nòmal nan yon anviwònman mantal nòmal. Analiz sa yo mete aksan sou eterojenite byolojik enpòtan nan popilasyon AsymAD la epi idantifye makè panèl ki ka kapab subtype moun nan premye etap maladi a. An jeneral, rezilta sa yo reprezante yon etap kle nan devlopman zouti biomarker pwoteyin ki baze sou plizyè sistèm ki ka rezoud avèk siksè anpil nan defi klinik AD fè fas a.
Objektif prensipal etid sa a se idantifye nouvo byomarkè likid serebrospinal ki reflete divès fizyoloji nan sèvo ki mennen nan AD. Figi S1 esplike metodoloji rechèch nou an, ki gen ladann (i) yon analiz konplè ki kondwi pa rezilta preliminè AD CSF ak pwoteòm sèvo rezo a pou idantifye plizyè byomarkè maladi CSF ki gen rapò ak sèvo, ak (ii) replikasyon ki vin apre sa yo se nan plizyè serebrospinal endepandan. kowòt likid. Rechèch ki oryante sou dekouvèt la te kòmanse ak analiz ekspresyon diferans CSF nan 20 moun ki nòmal kognitif ak 20 pasyan AD nan Sant Rechèch Maladi Alzayme Emory Goizueta (ADRC). Dyagnostik AD defini kòm yon pwoblèm mantal enpòtan nan prezans ba Aβ1-42 ak nivo ki wo nan total tau ak p-tau nan likid serebrospinal [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Tablo S1A). Kontwòl la (vle di MoCA, 26.7 ± 2.2) te gen nivo nòmal nan biomarqueurs CSF.
CSF imen karakterize pa yon seri dinamik nan abondans pwoteyin, nan ki albumin ak lòt pwoteyin trè abondan ka anpeche deteksyon an nan pwoteyin ki enterese (24). Pou ogmante pwofondè nan dekouvèt pwoteyin, nou retire premye 14 pwoteyin ki trè abondan nan chak echantiyon CSF anvan analiz mas spectrometri (MS) (24). MS te idantifye yon total de 39,805 peptides, ki te trase nan 3691 pwoteòm nan 40 echantiyon. Pwoteyin quantification fèt pa plizyè tandem mas tag (TMT) etikèt (18, 25). Yo nan lòd yo rezoud done ki manke yo, nou enkli sèlman pwoteyin sa yo ki te quantifye nan omwen 50% nan echantiyon yo nan analiz ki vin apre a, kidonk finalman quantifier 2875 proteomes. Akòz diferans siyifikatif nan nivo abondans total pwoteyin, yo te konsidere yon echantiyon kontwòl estatistikman kòm yon bagay ki abitye (13) epi li pa te enkli nan analiz ki vin apre a. Valè abondans rès 39 echantiyon yo te ajiste selon laj, sèks, ak kovarians pakèt (13-15, 17, 18, 20, 26).
Sèvi ak analiz estatistik t-tès pou evalye ekspresyon diferans sou seri done regresyon an, analiz sa a te idantifye pwoteyin ki gen nivo abondans yo te chanje anpil (P <0.05) ant ka kontwòl ak AD (Tablo S2A). Jan yo montre nan Figi 1A, abondans nan yon total de 225 pwoteyin nan AD te siyifikativman redwi, ak abondans nan 303 pwoteyin te siyifikativman ogmante. Pwoteyin sa yo diferan eksprime gen ladan plizyè makè AD likid serebrospinal idantifye deja, tankou tau pwoteyin ki asosye ak mikrotubule (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilaman (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Pwoteyin ki gen rapò ak kwasans 43. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Pwoteyin asid gra obligatwa 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 tankou 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Granulin Neural (NRGN; P = 3.43 × 10-4) ak faktè kwasans nè VGF (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Sepandan, nou menm tou nou te idantifye lòt objektif trè enpòtan, tankou GDP dissociation inhibitor 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) ak SPARC ki gen rapò ak modilè kalsyòm obligatwa 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analiz de 225 pwoteyin siyifikativman redwi revele koneksyon sere ak pwosesis likid kò tankou metabolis esteroyid, koagulasyon san, ak aktivite òmòn (Figi 1B ak Tablo S2B). Kontrèman, pwoteyin nan 303 siyifikativman ogmante se pre relasyon ak estrikti selil ak metabolis enèji.
(A) Trase vòlkan an montre chanjman pliye log2 (aks x) parapò ak valè P estatistik -log10 (aks y) ki te jwenn nan tès t la, ki itilize pou detekte ekspresyon diferans ant kontwòl (CT) ak AD ka nan CSF proteome nan tout pwoteyin. Pwoteyin ki gen nivo siyifikativman redwi (P <0.05) nan AD yo montre an ble, pandan y ap montre pwoteyin ki gen nivo siyifikativman ogmante nan maladi a an wouj. Pwoteyin chwazi a gen etikèt. (B) Tèm GO ki gen rapò ak pwoteyin yo siyifikativman redwi (ble) ak ogmante (wouj) nan AD. Montre twa tèm GO yo ak pi gwo nòt z nan domèn pwosesis byolojik, fonksyon molekilè, ak eleman selilè. (C) MS mezire nivo MAPT nan echantiyon CSF (agòch) ak korelasyon li yo ak nivo echantiyon ELISA tau (adwat). Koefisyan korelasyon Pearson ak valè P ki enpòtan yo parèt. Akòz mank de done ELISA pou yon ka AD, figi sa yo gen ladan valè pou 38 nan 39 ka analize yo. (D) Sipèvize analiz gwoup (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) ajiste P <0.01) sou kontwòl la ak AD CSF jwenn echantiyon lè l sèvi avèk 65 pwoteyin ki pi siyifikativman chanje nan seri done a. Normalize, nòmalize.
Nivo pwoteomik MAPT an se pre relasyon ak nivo ELISA tau ki mezire endepandan (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figi 1C), sipòte validite mezi MS nou an. Apre dijesyon trypsin nan nivo pwoteyin précurseur amiloid (APP), peptides izoform espesifik yo trase nan tèminal C nan Aβ1-40 ak Aβ1-42 pa ka ionize avèk efikasite (27, 28). Se poutèt sa, peptides APP nou idantifye yo pa gen anyen fè ak nivo ELISA Aβ1-42. Yo nan lòd yo evalye ekspresyon diferans nan chak ka, nou te itilize pwoteyin diferan eksprime ak P <0.0001 [pousantaj dekouvèt fo (FDR) korije P <0.01] fè yon analiz gwoup sipèvize nan echantiyon yo (Tablo S2A). Jan yo montre nan Figi 1D, 65 pwoteyin trè enpòtan sa yo ka byen grap echantiyon yo dapre eta maladi a, eksepte pou yon sèl ka AD ki gen karakteristik ki tankou kontwòl. Nan 65 pwoteyin sa yo, 63 ogmante nan AD, pandan y ap sèlman de (CD74 ak ISLR) diminye. An total, analiz likid serebrospinal sa yo te idantifye dè santèn de pwoteyin nan AD ki ka sèvi kòm biomarkers maladi.
Lè sa a, nou fè yon analiz rezo endepandan nan AD nan sèvo proteome. Kòwòt nan sèvo dekouvèt sa a enkli dorsolateral prefrontal cortical (DLPFC) ki soti nan kontwòl (n = 10), maladi Parkinson la (PD; n = 10), melanje AD / PD (n = 10) ak AD (n = 10). ) Egzanp. Emery Goizueta ADRC. Demografik 40 ka sa yo te deja dekri (25) epi yo rezime nan Tablo S1B. Nou itilize TMT-MS pou analize 40 tisi nan sèvo sa yo ak kowòt replikasyon 27 ka yo. An total, de seri done sèvo sa yo te pwodwi 227,121 peptides inik, ki te trase nan 12,943 pwoteòm (25). Se sèlman pwoteyin sa yo ki te quantifye nan omwen 50% nan ka yo te enkli nan envestigasyon ki vin apre yo. Seri done final dekouvèt la gen 8817 pwoteyin ki kantite. Ajiste nivo abondans pwoteyin ki baze sou laj, sèks, ak entèval post-mortem (PMI). Analiz ekspresyon diferans nan seri done a apre regresyon te montre ke > 2000 nivo pwoteyin yo te siyifikativman chanje [P <0.05, analiz divèjans (ANOVA)] nan de oswa plis kowòt maladi. Lè sa a, nou te fè yon analiz gwoup sipèvize ki baze sou pwoteyin yo eksprime diferans, ak P <0.0001 nan AD / kontwòl ak / oswa AD / PD konparezon (Figi S2, A ak B, Tablo S2C). Sa yo 165 pwoteyin trè chanje klèman dekri ka ak patoloji AD soti nan echantiyon kontwòl yo ak PD, ki konfime gwo chanjman espesifik AD yo nan tout proteome a.
Lè sa a, nou te itilize yon algorithm ki rele Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) pou fè analiz rezo sou pwoteòm nan sèvo dekouvri, ki òganize seri done a nan modil pwoteyin ak modèl ekspresyon menm jan an (11-13). Analiz la te idantifye 44 modil (M) ko-eksprime pwoteyin, klase ak nimewote soti nan pi gwo (M1, n = 1821 pwoteyin) nan pi piti a (M44, n = 34 pwoteyin) (Figi 2A ak Tablo S2D)). Kòm mansyone pi wo a (13) Kalkile pwofil ekspresyon reprezantan oswa pwoteyin karakteristik chak modil, epi korelasyon li ak eta maladi a ak patoloji AD, se sa ki, etabli alyans nan Rejis Maladi alzayme a (CERAD) ak Score Braak (Figi 2B). An jeneral, 17 modil yo te siyifikativman ki gen rapò ak AD neropatoloji (P <0.05). Anpil nan modil sa yo ki gen rapò ak maladi yo rich tou nan makè espesifik kalite selil yo (Figi 2B). Kòm mansyone pi wo a (13), anrichisman kalite selil yo detèmine pa analize sipèpoze modil la ak lis referans nan kalite selil espesifik jèn yo. Jèn sa yo sòti nan done pibliye nan newòn sourit izole, selil andotelyal ak glial. Eksperyans sekans RNA (RNA-seq) (29).
(A) Dekouvri WGCNA nan pwoteòm nan sèvo. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) analiz de pwoteyin siyati modilè (premye pi gwo eleman ekspresyon pwoteyin modilè) ak karakteristik neropatolojik AD (anwo), ki gen ladan nòt CERAD (Aβ plak) ak Braak (tau tangles). Entansite yo nan korelasyon pozitif (wouj) ak negatif (ble) yo montre pa yon kat chalè de koulè, ak asterisk endike siyifikasyon estatistik (P <0.05). Sèvi ak Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (anba) pou evalye asosyasyon kalite selil chak modil pwoteyin. Entansite lonbraj wouj la endike degre anrichisman kalite selil, ak asteris la endike siyifikasyon estatistik (P <0.05). Sèvi ak metòd BH pou korije valè P ki sòti nan FET la. (C) GO analiz de pwoteyin modilè. Pwosesis byolojik ki pi asosye yo montre pou chak modil oswa gwoup modil ki gen rapò. oligo, oligodendrocyte.
Yon seri senk modil ki gen anpil rapò ak astrosit ak mikroglia (M30, M29, M18, M24, ak M5) te montre yon gwo korelasyon pozitif ak neropatoloji AD (Figi 2B). Analiz Ontoloji lye modil glial sa yo ak kwasans selil, pwopagasyon, ak iminite (Figi 2C ak Tablo S2E). De modil glial adisyonèl, M8 ak M22, yo tou fòtman upregulated nan maladi. M8 gen anpil rapò ak chemen reseptè Toll-like, yon kaskad siyal ki jwe yon wòl kle nan repons iminitè natirèl la (30). An menm tan an, M22 se pre relasyon ak modifikasyon apre tradiksyon. M2, ki se moun rich nan oligodendrocytes, montre yon gwo korelasyon pozitif ak patoloji AD ak yon koneksyon ontolojik ak sentèz nukleozid ak replikasyon ADN, ki endike pwopagasyon selil amelyore nan maladi. An jeneral, rezilta sa yo sipòte elevasyon modil glial ke nou te deja obsève nan pwoteòm rezo AD (13, 17). Kounye a li jwenn ke anpil modil glial ki gen rapò ak AD nan rezo a montre nivo ekspresyon ki pi ba nan ka kontwòl ak PD, mete aksan sou espesifik maladi yo ki elve nan AD (Figi S2C).
Se sèlman kat modil nan proteome rezo nou an (M1, M3, M10, ak M32) yo fòtman negatif korelasyon ak patoloji AD (P <0.05) (Figi 2, B ak C). Tou de M1 ak M3 yo rich nan makè newòn. M1 se trè ki gen rapò ak siyal sinaptik, pandan y ap M3 se pre relasyon ak fonksyon mitokondriyo. Pa gen okenn prèv ki montre kalite selil anrichisman pou M10 ak M32. M32 reflete koneksyon ki genyen ant M3 ak metabolis selilè, pandan y ap M10 trè gen rapò ak kwasans selil ak fonksyon mikrotubul. Konpare ak AD, tout kat modil yo ogmante nan kontwòl ak PD, ki ba yo chanjman AD espesifik maladi yo (Figi S2C). An jeneral, rezilta sa yo sipòte abondans diminye nan modil newòn ki rich ke nou te deja obsève nan AD (13, 17). An rezime, analiz rezo pwoteòm nan sèvo ke nou dekouvri te pwodwi modil AD-espesyalman chanje ki konsistan avèk rezilta anvan nou yo.
AD karakterize pa yon etap bonè asymptomatic (AsymAD), kote moun yo montre akimilasyon amiloid san yo pa n bès nan klinik mantal (5, 31). Etap san sentòm sa a reprezante yon fenèt kritik pou deteksyon ak entèvansyon bonè. Nou te deja demontre fò prezèvasyon modilè nan AsymAD ak AD rezo sèvo pwoteòm atravè seri done endepandan (13, 17). Pou nou asire rezo sèvo nou dekouvri kounye a ki konsistan avèk rezilta sa yo anvan yo, nou analize prezèvasyon 44 modil nan seri done repwodwi ki soti nan 27 òganizasyon DLPFC. Òganizasyon sa yo enkli ka kontwòl (n = 10), AsymAD (n = 8) ak ka AD (n = 9). Kontwòl ak echantiyon AD yo te enkli nan analiz kòwòt sèvo dekouvèt nou an (Tablo S1B), pandan y ap ka AsymAD yo te inik sèlman nan kòwòt replikasyon an. Ka AsymAD sa yo te soti tou nan bank sèvo Emory Goizueta ADRC. Malgre ke koyisyon te nòmal nan moman lanmò a, nivo amiloid yo te nòmalman wo (vle di CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tablo S1B).
TMT-MS analiz de 27 tisi sèvo sa yo te lakòz quantification de 11,244 proteomes. Konte final sa a gen ladan sèlman pwoteyin sa yo ki mezire nan omwen 50% echantiyon yo. Sa a seri done repwodwi gen 8638 (98.0%) nan 8817 pwoteyin yo detekte nan analiz nan sèvo dekouvèt nou an, e li gen prèske 3000 pwoteyin ki chanje anpil ant kowòt kontwòl ak AD (P <0.05, apre tès T Tukey a pè pou analiz divèjans) ( Tablo S2F). Pami pwoteyin diferan eksprime sa yo, 910 te montre tou chanjman enpòtan nan nivo ant AD ak ka kontwòl pwoteòm nan sèvo (P <0.05, apre ANOVA Tukey pè t-tès). Li vo sonje ke makè 910 sa yo trè konsistan nan direksyon chanjman ant proteom (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figi S3A). Pami pwoteyin ki ogmante yo, pwoteyin ki gen chanjman ki pi konsistan ant seri done yo se sitou manm modil M5 ak M18 glial ki rich (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, ak GFAP). Pami pwoteyin redwi yo, moun ki gen chanjman ki pi konsistan yo te prèske sèlman manm modil M1 (NPTX2, VGF, ak RPH3A) ki asosye ak sinaps la. Nou verifye plis chanjman ki gen rapò ak AD nan midkine (MDK), CD44, sekrete pwoteyin ki gen rapò ak frizzled 1 (SFRP1) ak VGF pa Western blotting (Figi S3B). Analiz modil prezèvasyon te montre ke apeprè 80% nan modil pwoteyin (34/44) nan proteome nan sèvo yo te siyifikativman konsève nan seri done replikasyon (z-score> 1.96, FDR korije P <0.05) (Figi S3C). Katòz nan modil sa yo te rezève espesyalman ant de proteom yo (z-score> 10, FDR korije P <1.0 × 10-23). An jeneral, dekouvèt la ak replikasyon wo degre de konsistans nan ekspresyon diferans ak konpozisyon modilè ant pwoteòm nan sèvo mete aksan sou repwodiksyon nan chanjman ki fèt nan AD frontal cortical pwoteyin. Anplis de sa, li konfime tou ke AsymAD ak maladi ki pi avanse gen yon estrikti rezo sèvo ki sanble anpil.
Yon analiz pi detaye sou ekspresyon diferans lan nan seri done replikasyon nan sèvo a mete aksan sou degre enpòtan nan chanjman pwoteyin AsymAD, ki gen ladan yon total de 151 pwoteyin ki chanje anpil ant AsymAD ak kontwòl la (P <0.05) (Figi S3D). Konfòm ak chaj amiloid la, APP nan sèvo AsymAD ak AD ogmante anpil. MAPT sèlman chanje siyifikativman nan AD, ki se ki konsistan avèk nivo ogmante nan tangle ak korelasyon li te ye ak n bès mantal (5, 7). Modil glial ki rich yo (M5 ak M18) yo trè reflete nan pwoteyin ki ogmante nan AsymAD, pandan y ap modil M1 ki gen rapò ak newòn se pi reprezantan pwoteyin yo diminye nan AsymAD. Anpil nan makè AsymAD sa yo montre pi gwo chanjman nan maladi sentòm yo. Pami makè sa yo se SMOC1, yon pwoteyin glial ki fè pati M18, ki asosye ak timè nan sèvo ak devlopman nan je ak branch (32). MDK se yon faktè kwasans eparin ki gen rapò ak kwasans selil ak anjojenèz (33), yon lòt manm nan M18. Konpare ak gwoup kontwòl la, AsymAD ogmante anpil, ki te swiv pa yon pi gwo ogmantasyon nan AD. Kontrèman, pwoteyin sinaptik neuropentraxin 2 (NPTX2) te siyifikativman redwi nan sèvo AsymAD la. NPTX2 te deja asosye ak neurodegeneration e li gen yon wòl rekonèt nan medyatè sinaps eksitasyon (34). An jeneral, rezilta sa yo revele yon varyete diferan chanjman pwoteyin preklinik nan AD ki sanble pwogrese ak gravite maladi a.
Etandone ke nou te reyalize yon pwofondè siyifikatif nan pwoteksyon pwoteyin nan dekouvèt la nan pwoteòm nan sèvo, nou ap eseye konprann pi byen sipèpoze li yo ak transcriptome AD nan nivo rezo a. Se poutèt sa, nou te konpare pwoteòm nan sèvo nou dekouvri ak modil nou te deja pwodwi nan mezi mikro 18,204 jèn nan AD (n = 308) ak kontwòl (n = 157) tisi DLPFC (13). sipèpoze. An total, nou idantifye 20 modil RNA diferan, anpil nan yo te demontre anrichisman nan kalite selil espesifik, ki gen ladan newòn, oligodendrosit, astrosit, ak mikroglia (Figi 3A). Chanjman miltip nan modil sa yo nan AD yo montre nan Figi 3B. Konfòm ak analiz anvan nou an sipèpoze pwoteyin-RNA lè l sèvi avèk pwoteòm MS ki pa gen etikèt ki pi fon (apeprè 3000 pwoteyin) (13), pi fò nan 44 modil yo nan rezo pwoteòm sèvo nou te jwenn yo nan rezo transcriptome a Pa gen okenn sipèpoze enpòtan. dekouvèt nou an ak replikasyon nan 34 modil pwoteyin ki trè konsève nan pwoteòm nan sèvo a, sèlman 14 (~40%) te pase tès egzak Fisher a (FET) te pwouve yo gen yon sipèpoze estatistik enpòtan ak transcriptom la (Figi 3A). Konpatib ak reparasyon domaj ADN (P-M25 ak P-M19), tradiksyon pwoteyin (P-M7 ak P-M20), RNA obligatwa / splicing (P-M16 ak P-M21) ak vize pwoteyin (P-M13 ak P-). M23) pa sipèpoze ak modil nan transcriptome la. Se poutèt sa, byenke yon seri done pwoteòm pi fon yo itilize nan analiz aktyèl la sipèpoze (13), pi fò nan pwoteòm rezo AD yo pa trase nan rezo transcriptome a.
(A) FET ipèjometrik demontre anrichisman makè espesifik kalite selil yo nan modil RNA nan transcriptom AD (anwo) ak degre sipèpoze ant modil RNA (aks x) ak pwoteyin (aks y) nan sèvo AD. (anba). Entansite lonbraj wouj la endike degre anrichisman kalite selil yo nan panèl anwo a ak entansite sipèpoze modil yo nan panèl anba a. Asterisk endike siyifikasyon estatistik (P <0.05). (B) Degre korelasyon ant jèn karakteristik chak modil transcriptome ak estati AD. Modil ki sou bò gòch yo se pi negatif korelasyon ak AD (ble), ak sa ki sou bò dwat yo se pi pozitif korelasyon ak AD (wouj). Valè P korije BH transfòme nan boutèy demi lit la endike degre siyifikasyon estatistik chak korelasyon. (C) Modil sipèpoze enpòtan ak anrichisman kalite selil pataje. (D) Analiz korelasyon chanjman log2 pliye nan pwoteyin ki make (aks x) ak RNA (aks y) nan modil la sipèpoze. Koefisyan korelasyon Pearson ak valè P ki enpòtan yo parèt. Mikwo, mikroglia; kò selès, astwosit. CT, kontwòl.
Pifò sipèpoze pwoteyin ak modil RNA pataje pwofil anrichisman kalite selil ki sanble ak direksyon chanjman AD ki konsistan (Figi 3, B ak C). Nan lòt mo, modil M1 ki gen rapò ak sinaps nan pwoteòm nan sèvo (PM1) se trase nan twa modil RNA omològ newòn ki rich (R-M1, R-M9 ak R-M16), ki nan AD Tou de te montre. yon nivo redwi. Menm jan an tou, modil pwoteyin glial-rich M5 ak M18 sipèpoze ak modil RNA ki rich nan astwosit ak makè microglial (R-M3, R-M7, ak R-M10) epi yo trè patisipe nan Ogmante maladi. Karakteristik modilè pataje sa yo ant de seri done yo plis sipòte anrichisman kalite selil la ak chanjman ki gen rapò ak maladi nou te obsève nan pwoteòm nan sèvo. Sepandan, nou te obsève anpil diferans enpòtan ant nivo RNA ak pwoteyin makè endividyèl yo nan modil pataje sa yo. Analiz korelasyon ekspresyon diferans nan pwoteomik ak transkriptomik molekil ki nan modil sipèpoze sa yo (Figi 3D) mete aksan sou enkonsistans sa a. Pou egzanp, APP ak plizyè lòt pwoteyin modil glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, ak SFRP1) te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan AD proteome a, men pa te gen prèske pa gen okenn chanjman nan transcriptome AD la. Chanjman espesifik pwoteyin sa yo ka gen rapò ak plak amiloid (23, 35), mete aksan sou proteome a kòm sous chanjman patolojik, epi chanjman sa yo ka pa reflete nan transcriptom la.
Apre yo fin analize endepandamman sèvo a ak CSF pwoteòm nou dekouvri, nou te fè yon analiz konplè sou de seri done yo idantifye AD CSF byomarkè ki gen rapò ak fizyopatoloji rezo a nan sèvo. Nou dwe premye defini sipèpoze de proteom yo. Malgre ke li lajman aksepte ke CSF reflete chanjman nerochimik nan sèvo AD (4), degre egzak la nan sipèpoze ant sèvo AD ak proteome CSF la pa klè. Lè nou konpare kantite pwodwi jèn pataje yo detekte nan de proteom nou yo, nou te jwenn ke prèske 70% (n = 1936) nan pwoteyin yo idantifye nan likid serebrospinal la te quantifye tou nan sèvo a (Figi 4A). Pifò nan pwoteyin sipèpoze sa yo (n = 1721) yo trase nan youn nan 44 modil ko-ekspresyon ki soti nan seri done nan sèvo dekouvèt (Figi 4B). Kòm espere, sis pi gwo modil sèvo yo (M1 rive M6) montre pi gwo kantite sipèpoze CSF. Sepandan, gen pi piti modil sèvo (pa egzanp, M15 ak M29) ki reyalize yon wo degre de sipèpoze, pi gwo pase yon modil sèvo de fwa gwosè li. Sa a motive nou adopte yon metòd ki pi detaye, ki baze sou estatistik pou kalkile sipèpoze ant sèvo a ak likid serebrospinal.
(A ak B) Pwoteyin yo detekte nan sèvo a dekouvèt ak seri done CSF sipèpoze. Pifò nan pwoteyin sipèpoze sa yo asosye ak youn nan 44 modil ko-ekspresyon rezo ko-ekspresyon sèvo a. (C) Dekouvri sipèpoze ant pwoteòm likid cerebrospinal la ak pwoteòm rezo sèvo a. Chak ranje kat chalè a reprezante yon analiz separe sipèpoze FET ipèjometrik la. Ranje anlè a montre sipèpoze (gri/nwa lonbraj) ant modil sèvo a ak tout pwoteòm CSF la. Dezyèm liy lan montre ke sipèpoze ant modil sèvo ak pwoteyin CSF (lonbraj nan wouj) se siyifikativman moute-reglemante nan AD (P <0.05). Twazyèm ranje a montre ke sipèpoze ant modil sèvo ak pwoteyin CSF (lonbraj ble) se siyifikativman desann-reglemante nan AD (P <0.05). Sèvi ak metòd BH pou korije valè P ki sòti nan FET la. (D) Pliye panèl modil ki baze sou asosyasyon kalite selil ak tèm GO ki gen rapò. Panno sa yo genyen yon total de 271 pwoteyin ki gen rapò ak sèvo, ki gen ekspresyon diferans ki gen sans nan proteome CSF la.
Sèvi ak yon sèl-tailed FETs, nou evalye enpòtans ki genyen nan sipèpoze pwoteyin ant CSF proteome a ak modil sèvo endividyèl yo. Analiz la te revele ke yon total de 14 modil sèvo nan seri done CSF la gen sipèpoze estatistik enpòtan (FDR ajiste P <0.05), ak yon modil adisyonèl (M18) ki gen sipèpoze tou pre siyifikasyon (FDR ajiste P = 0.06) (Figi 4C). , ranje anlè). Nou enterese tou nan modil ki sipèpoze fòtman ak pwoteyin CSF diferan eksprime. Se poutèt sa, nou te aplike de analiz FET adisyonèl pou detèmine kilès nan (i) pwoteyin CSF te siyifikativman ogmante nan AD ak (ii) pwoteyin CSF te siyifikativman diminye nan AD (P <0.05, pè t tès AD / kontwòl) Modil sèvo ak sipèpoze siyifikatif. ant yo. Jan yo montre nan ranje mitan ak anba nan Figi 4C, analiz adisyonèl sa yo montre ke 8 nan 44 modil sèvo yo siyifikativman sipèpoze ak pwoteyin ki te ajoute nan AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, ak M38) . ), pandan ke sèlman de modil (M6 ak M15) te montre yon sipèpoze siyifikatif ak pwoteyin nan redwi nan AD CSF. Kòm espere, tout 10 modil yo nan 15 modil yo ak sipèpoze ki pi wo a ak proteome CSF la. Se poutèt sa, nou sipoze ke 15 modil sa yo se sous segondè-sede nan AD nan sèvo-derivan CSF byomarkers.
Nou pliye 15 modil sipèpoze sa yo nan senk gwo panno pwoteyin ki baze sou pwoksimite yo nan dyagram nan pyebwa WGCNA ak asosyasyon yo ak kalite selil ak ontoloji jèn (Figi 4D). Premye panèl la gen modil ki rich nan makè newòn ak pwoteyin ki gen rapò ak sinaps (M1 ak M12). Panèl sinaptik la gen yon total de 94 pwoteyin, ak nivo yo nan CSF proteome a te chanje anpil, sa ki fè li pi gwo sous makè CSF ki gen rapò ak sèvo pami senk panno yo. Dezyèm gwoup la (M6 ak M15) te demontre koneksyon sere ak makè selil andothelial ak kò vaskilè, tankou "gerizon blesi" (M6) ak "règleman repons iminitè umoral" (M15). M15 se tou trè ki gen rapò ak metabolis lipoprotein, ki se pre relasyon ak andotelyom (36). Panèl vaskilè a gen 34 makè CSF ki gen rapò ak sèvo a. Twazyèm gwoup la gen ladan modil (M2 ak M4) ki gen rapò siyifikativman ak makè oligodendrocyte ak pwopagasyon selil. Pou egzanp, tèm ontoloji tèt nivo nan M2 gen ladan "règleman pozitif nan replikasyon ADN" ak "pwosesis biosentèz purin". Pandan se tan, sa yo ki nan M4 gen ladan "diferansasyon selil glial" ak "segregasyon kwomozòm". Panèl myelination la gen 49 makè CSF ki gen rapò ak sèvo a.
Katriyèm gwoup la gen plis modil yo (M30, M29, M18, M24, ak M5), ak prèske tout modil yo siyifikativman rich nan mikroglia ak makè astrocyte. Menm jan ak panèl myelination la, katriyèm panèl la tou gen modil (M30, M29, ak M18) ki gen rapò ak pwopagasyon selil yo. Lòt modil yo nan gwoup sa a trè ki gen rapò ak tèm iminolojik, tankou "pwosesis efè iminitè" (M5) ak "règleman repons iminitè" (M24). Gwoup iminitè glial la gen 42 makè CSF ki gen rapò ak sèvo a. Finalman, dènye panèl la gen ladan 52 makè ki gen rapò ak sèvo sou kat modil yo (M44, M3, M33, ak M38), yo tout sou kò a ki gen rapò ak depo enèji ak metabolis. Pi gwo nan modil sa yo (M3) gen rapò ak mitokondri epi li rich nan makè espesifik newòn yo. M38 se youn nan manm modil ki pi piti nan metabolom sa a epi tou li montre espesifik newòn modere.
An jeneral, senk panno sa yo reflete yon pakèt kalite selil ak fonksyon nan cortical AD la, epi yo genyen kolektivman 271 makè CSF ki gen rapò ak sèvo (Tablo S2G). Yo nan lòd yo evalye validite rezilta MS sa yo, nou te itilize tès ekstansyon pwoksimite (PEA), yon teknoloji orthogonal ki baze sou antikò ki gen kapasite multiplexing, gwo sansiblite ak espesifik, epi nou te analize echantiyon likid serebrospinal nou te jwenn. (n = 36). Objektif 36 sa yo demontre chanjman nan miltip AD PEA a, ki gen rapò sere ak konklizyon MS nou yo ki baze sou (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) , Ki fòtman verifye rezilta analiz MS konplè nou an (Figi S4). ).
Tèm byolojik yo mete aksan sou senk gwoup nou yo, soti nan siyal sinaptik nan metabolis enèji, yo tout ki gen rapò ak patojèn nan AD (1-3). Se poutèt sa, tout 15 modil ki gen panno sa yo gen rapò ak patoloji AD nan pwoteòm nan sèvo ke nou dekouvri (Figi 2B). Ki pi remakab la se gwo korelasyon patolojik pozitif ant modil glial nou yo ak gwo korelasyon patolojik negatif ant pi gwo modil newòn nou an (M1 ak M3). Analiz ekspresyon diferansye pwoteòm sèvo nou an (Figi S3D) mete aksan sou pwoteyin glial ki sòti nan M5 ak M18. Nan AsymAD ak AD sentòm, pi ogmante pwoteyin glial yo ak sinaps ki gen rapò ak M1 Pwoteyin nan redwi pi plis. Obsèvasyon sa yo endike ke 271 makè likid serebrospinal nou idantifye nan senk gwoup yo gen rapò ak pwosesis maladi nan cortical AD la, ki gen ladan sa yo ki rive nan premye etap yo senptomatik.
Pou pi byen analize direksyon chanjman nan pwoteyin panèl yo nan sèvo a ak likid epinyè a, nou te trase sa ki annapre yo pou chak nan 15 modil sipèpoze yo: (i) jwenn nivo abondans modil la nan seri done sèvo a ak (ii) modil la. pwoteyin Diferans lan eksprime nan likid serebrospinal la (Figi S5). Kòm mansyone pi bonè, WGCNA yo itilize pou detèmine abondans modil la oswa valè pwoteyin karakteristik nan sèvo a (13). Yo itilize kat vòlkan an pou dekri ekspresyon diferans nan pwoteyin modilè nan likid serebrospinal (AD/kontwòl). Figi sa yo montre ke twa nan senk panno yo montre tandans ekspresyon diferan nan sèvo a ak likid epinyè. De modil yo nan panèl sinaps la (M1 ak M12) montre yon diminisyon nan nivo abondans nan sèvo AD, men siyifikativman sipèpoze ak pwoteyin ki ogmante nan AD CSF la (Figi S5A). Modil ki gen rapò ak newòn yo ki gen metabolom la (M3 ak M38) te montre modèl ekspresyon ki sanble nan sèvo ak serebrospinal likid enkonsistan (Figi S5E). Panèl vaskilè a te montre tou diferan tandans ekspresyon, byenke modil li yo (M6 ak M15) te ogmante modere nan sèvo AD ak diminye nan CSF malad la (Figi S5B). De panno ki rete yo gen gwo rezo glial ki gen pwoteyin yo toujou kontwole nan tou de konpatiman yo (Figi S5, C ak D).
Tanpri sonje ke tandans sa yo pa komen nan tout makè nan panno sa yo. Pou egzanp, panèl sinaptik la gen ladan plizyè pwoteyin ki siyifikativman redwi nan sèvo AD ak CSF (Figi S5A). Pami makè likid serebrospinal sa yo se NPTX2 ak VGF nan M1, ak chromogranin B nan M12. Sepandan, malgre eksepsyon sa yo, pi fò nan makè sinaptik nou yo elve nan likid epinyè AD. An jeneral, analiz sa yo te kapab distenge tandans estatistik enpòtan nan sèvo ak nivo likid serebrospinal nan chak nan senk panno nou yo. Tandans sa yo mete aksan sou relasyon konplèks ak souvan diferan ant ekspresyon pwoteyin nan sèvo ak CSF nan AD.
Lè sa a, nou te itilize analiz MS replikasyon wo-debi (CSF replikasyon 1) pou etwat seri 271 biomarkers nou an nan objektif ki pi pwomèt ak repwodiktif (Figi 5A). CSF kopi 1 gen yon total 96 echantiyon ki soti nan Emory Goizueta ADRC, ki gen ladan kontwòl, AsymAD, ak AD kòwòt (Tablo S1A). Ka AD sa yo karakterize pa modere n bès mantal (vle di MoCA, 20.0 ± 3.8), ak chanjman nan byomarkè AD konfime nan likid serebrospinal (Tablo S1A). Kontrèman ak analiz CSF nou te jwenn, replikasyon sa a fèt lè l sèvi avèk yon metòd MS "yon sèl-piki" ki pi efikas ak wo-debi (san yo pa fraksyon nan liy), ki gen ladan yon pwotokòl preparasyon echantiyon senplifye ki elimine nesesite pou iminitè echantiyon endividyèl yo. . Olye de sa, yo itilize yon sèl "chanèl amelyorasyon" iminitè-apovri pou anplifye siyal pwoteyin mwens abondan (37). Malgre ke li diminye pwoteksyon total pwoteòm, metòd sèl-piki sa a siyifikativman diminye tan machin ak ogmante kantite echantiyon ki gen etikèt TMT ki ka analize solid (17, 38). An total, analiz la te idantifye 6,487 peptides, ki te trase nan 1,183 pwoteòm nan 96 ka. Menm jan ak analiz CSF nou te jwenn, se sèlman pwoteyin sa yo ki mezire nan omwen 50% echantiyon yo te enkli nan kalkil ki vin apre yo, epi done yo te regrese pou efè laj ak sèks. Sa a te mennen nan quantifikasyon final la nan 792 pwoteòm, 95% nan yo te idantifye tou nan seri done CSF yo te jwenn.
(A) Objektif pwoteyin CSF ki gen rapò ak sèvo verifye nan premye kòwòt CSF ki repwodwi epi yo enkli nan panèl final la (n = 60). (B rive E) Nivo biomarker Panel (z-scores konpoze) mezire nan kat kowòt replikasyon CSF yo. Tès pè oswa ANOVA ak apre koreksyon Tukey yo te itilize pou evalye siyifikasyon estatistik chanjman nan abondans nan chak analiz repwodui. CT, kontwòl.
Piske nou patikilyèman enterese nan verifye 271 objektif CSF ki gen rapò ak sèvo nou yo atravè analiz konplè, nou pral limite plis egzamen an nan pwoteòm repwodwi sa a nan makè sa yo. Pami 271 pwoteyin sa yo, yo te detekte 100 nan replikasyon CSF 1. Figi S6A montre ekspresyon diferans 100 makè sipèpoze sa yo ant echantiyon kontwòl ak replikasyon AD yo. Iston sinaptik ak metabolit ogmante pi plis nan AD, pandan y ap pwoteyin vaskilè diminye pi plis nan maladi. Pifò nan 100 makè yo sipèpoze (n = 70) kenbe menm direksyon an nan chanjman nan de seri done yo (Figi S6B). 70 makè CSF valide ki gen rapò ak sèvo sa yo (Tablo S2H) lajman reflete tandans ekspresyon panèl yo te obsève deja, se sa ki, règleman desann nan pwoteyin vaskilè ak règleman moute nan tout lòt panno. Se sèlman 10 nan 70 pwoteyin valide sa yo te montre chanjman nan abondans AD ki kontredi tandans panèl sa yo. Yo nan lòd yo jenere yon panèl ki pi byen reflete tandans an jeneral nan sèvo a ak likid serebrospinal, nou eskli 10 pwoteyin sa yo nan panèl la nan enterè ke nou finalman verifye (Figi 5A). Se poutèt sa, panèl nou an finalman gen ladan yon total de 60 pwoteyin verifye nan de kòwòt endepandan CSF AD lè l sèvi avèk preparasyon echantiyon diferan ak analiz platfòm MS. Trase ekspresyon z-score panno final sa yo nan kontwòl CSF kopi 1 ak ka AD konfime tandans panèl yo obsève nan kòwòt CSF nou te jwenn (Figi 5B).
Pami 60 pwoteyin sa yo, gen molekil ki asosye ak AD, tankou osteopontin (SPP1), ki se yon sitokin pro-enflamatwa ki te asosye ak AD nan anpil etid (39-41), ak GAP43, Yon pwoteyin sinaptik. ki klèman lye ak neurodegeneration (42). Pwoteyin ki pi konplètman verifye yo se makè ki gen rapò ak lòt maladi neurodegenerative, tankou paralezit lateral amyotwofik (ALS) ki gen rapò ak superoksid dismutase 1 (SOD1) ak maladi Parkinson ki gen rapò ak desaccharase (PARK7). Nou te verifye tou ke anpil lòt makè, tankou SMOC1 ak sèvo ki rich manbràn siyal pwoteyin 1 (BASP1), te limite lyen anvan yo neurodegeneration. Li se yon valè de sonje ke akòz abondans ki ba yo an jeneral nan proteome CSF a, li difisil pou nou sèvi ak metòd deteksyon sèl-piki gwo-debi sa a pou detekte seryezman MAPT ak sèten lòt pwoteyin ki gen rapò ak AD (pa egzanp, NEFL ak NRGN. ) (43, 44).
Lè sa a, nou tcheke 60 makè panèl priyorite sa yo nan twa analiz repwodwi adisyonèl. Nan CSF Kopi 2, nou te itilize yon sèl TMT-MS pou analize yon kòwòt endepandan 297 kontwòl ak echantiyon AD ki soti nan Emory Goizueta ADRC (17). CSF replikasyon 3 enkli yon re-analiz done ki disponib TMT-MS ki soti nan 120 kontwòl ak pasyan AD ki soti nan Lausanne, Swis (45). Nou detekte plis pase de tyè nan 60 makè priyorite yo nan chak seri done. Malgre ke etid Swis la te itilize diferan MS tribin ak metòd quantification TMT (45, 46), nou fòtman repwodui tandans panèl nou an nan de analiz repete (Figi 5, C ak D, ak Tablo S2, I, ak J). Pou evalye espesifik maladi gwoup nou an, nou te itilize TMT-MS pou analize katriyèm done replikasyon an (CSF replikasyon 4), ki te gen ladan pa sèlman kontwòl (n = 18) ak AD (n = 17) ka, men tou PD ( n = 14)), ALS (n = 18) ak echantiyon frontotemporal demans (FTD) (n = 11) (Tablo S1A). Nou te byen mezire prèske de tyè nan pwoteyin panèl yo nan kòwòt sa a (38 sou 60). Rezilta sa yo mete aksan sou chanjman AD espesifik yo nan tout senk panno biomarker (Figi 5E ak Tablo S2K). Ogmantasyon nan gwoup metabolit la te montre espesifik AD ki pi fò, ki te swiv pa myelination ak gwoup glial la. Nan yon pi piti limit, FTD montre tou yon ogmantasyon ant panno sa yo, ki ka reflete menm chanjman potansyèl rezo (17). Kontrèman, ALS ak PD te montre prèske menm pwofil myelination, glial ak metabolom kòm gwoup kontwòl la. An jeneral, malgre diferans ki genyen nan preparasyon echantiyon, platfòm MS, ak metòd quantifikasyon TMT, analiz repete sa yo montre ke makè panèl priyorite nou yo gen chanjman trè konsistan AD-espesifik nan plis pase 500 echantiyon inik CSF.
AD neurodegeneration te lajman rekonèt plizyè ane anvan aparisyon sentòm mantal yo, kidonk gen yon bezwen ijan pou byomarkè AsymAD (5, 31). Sepandan, pi plis ak plis prèv montre ke byoloji AsymAD se byen lwen soti nan omojèn, ak entèraksyon an konplèks nan risk ak rezistans mennen nan gwo diferans endividyèl nan pwogresyon maladi ki vin apre (47). Malgre ke yo itilize pou idantifye ka AsymAD yo, nivo biomaketè nwayo CSF (Aβ1-42, total tau ak p-tau) pa te pwouve ke yo kapab fyab predi ki moun ki pral pwogrese nan demans (4, 7), ki endike plis Li kapab nesesè pou mete zouti biomarker holistic ki baze sou plizyè aspè nan fizyoloji sèvo pou byen stratifye risk popilasyon sa a. Se poutèt sa, nou imedyatman analize panèl byomarkè AD-valide nou an nan popilasyon AsymAD nan kopi CSF 1. 31 ka AsymAD sa yo te montre nivo nòmal byomarkè nwayo (Aβ1-42 / total tau ELISA rapò, <5.5) ak koyisyon konplè (vle di MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tablo S1A). Anplis de sa, tout moun ki gen AsymAD gen yon nòt demans nan klinik 0, ki endike ke pa gen okenn prèv ki montre yon bès nan pèfòmans chak jou mantal oswa fonksyonèl.
Nou te premye analize nivo panno yo valide nan tout 96 CSF replike 1, ki gen ladan kòwòt AsymAD la. Nou te jwenn ke plizyè panno nan gwoup AsymAD la te gen chanjman enpòtan AD ki tankou abondans, panèl vaskilè a te montre yon tandans anba nan AsymAD, pandan tout lòt panno yo te montre yon tandans anlè (Figi 6A). Se poutèt sa, tout panno yo te montre yon korelasyon trè enpòtan ak ELISA Aβ1-42 ak nivo total tau (Figi 6B). Kontrèman, korelasyon ant gwoup la ak nòt MoCA a relativman pòv. Youn nan rezilta ki pi frape nan analiz sa yo se gwo seri abondans panèl nan kòwòt AsymAD la. Jan yo montre nan Figi 6A, nivo panèl gwoup AsymAD a anjeneral travèse nivo panèl gwoup kontwòl la ak gwoup AD, ki montre relativman wo varyasyon. Pou plis eksplore eterojenite AsymAD sa a, nou te aplike analiz Multidimensional Scaling (MDS) nan 96 CSF replikasyon 1 ka. Analiz MDS pèmèt yo vizyalize resanblans ki genyen ant ka yo ki baze sou sèten varyab nan seri done a. Pou analiz gwoup sa a, nou sèlman itilize makè panèl valide sa yo ki gen yon chanjman estatistik enpòtan (P <0.05, AD/kontwòl) nan dekouvèt CSF ak replikasyon 1 proteom (n = 29) (Tablo S2L). Analiz sa a te pwodwi yon gwoup klè espasyal ant kontwòl nou yo ak ka AD yo (Figi 6C). Kontrèman, kèk ka AsymAD yo byen klè gwoupe nan gwoup kontwòl la, pandan ke lòt yo sitiye nan ka AD. Pou plis eksplore eterojenite AsymAD sa a, nou itilize kat MDS nou an pou defini de gwoup ka AsymAD sa yo. Premye gwoup la enkli ka AsymAD ki te rasanble pi pre kontwòl la (n = 19), pandan y ap dezyèm gwoup la te karakterize pa ka AsymAD ak yon pwofil makè ki pi pre AD (n = 12).
(A) Nivo ekspresyon (z-score) gwoup biomarker CSF nan tout echantiyon 96 nan kòwòt CSF replikasyon 1, ki gen ladan AsymAD. Yo te itilize analiz divèjans ak koreksyon apre Tukey pou evalye siyifikasyon estatistik chanjman abondans panèl yo. (B) Analiz korelasyon nivo abondans pwoteyin panèl (z-score) ak nòt MoCA ak nivo total tau nan echantiyon ELISA Aβ1-42 ak CSF kopi 1. Koefisyan korelasyon Pearson ak valè P ki enpòtan yo parèt. (C) MDS nan 96 CSF kopi 1 ka yo te baze sou nivo abondans nan 29 makè panèl valide, ki te siyifikativman chanje nan tou de dekouvèt la ak CSF kopi 1 done ansanm [P <0.05 AD / kontwòl (CT)]. Yo te itilize analiz sa a pou divize gwoup AsymAD a an gwoup kontwòl (n = 19) ak AD (n = 12). (D) Trase vòlkan an montre ekspresyon diferans tout CSF replikasyon 1 pwoteyin ak log2 pliye chanjman (x-aks) parapò ak valè P estatistik -log10 ant de sougwoup AsymAD yo. Biomarkers panèl yo gen koulè. (E) CSF replikasyon 1 nivo abondans nan biomake gwoup seleksyon yo diferan eksprime ant subgroup AsymAD. Yo te itilize analiz post-ajiste Tukey nan divèjans pou evalye siyifikasyon estatistik.
Nou egzamine ekspresyon pwoteyin diferans ant kontwòl sa yo ak ka AsymAD ki tankou AD (Figi 6D ak Tablo S2L). Kat jeyografik vòlkan ki lakòz yo montre ke 14 makè panèl yo te chanje anpil ant de gwoup yo. Pifò nan makè sa yo se manm sinaps la ak metabolom. Sepandan, SOD1 ak myristoylated alanine ki rich pwoteyin kinaz C substrate (MARCKS), ki se manm gwoup iminitè myelin ak glial, respektivman, tou fè pati gwoup sa a (Figi 6, D ak E). Panèl vaskilè a te kontribye tou de makè ki te siyifikativman redwi nan gwoup AsymAD ki tankou AD, ki gen ladan pwoteyin obligatwa AE 1 (AEBP1) ak manm fanmi C9 konpleman. Pa te gen okenn diferans enpòtan ant kontwòl ak AD-tankou AsymAD sou gwoup nan ELISA AB1-42 (P = 0.38) ak p-tau (P = 0.28), men te gen vre yon diferans enpòtan nan nivo total tau (P = 0.0031). ) (Fig. S7). Gen plizyè makè panèl ki endike ke chanjman ki genyen ant de sougwoup AsymAD yo pi enpòtan pase nivo total tau yo (pa egzanp, YWHAZ, SOD1, ak MDH1) (Figi 6E). An jeneral, rezilta sa yo endike ke panèl valide nou an ka gen ladan biomarqueurs ki ka subtype ak potansyèl stratifikasyon risk nan pasyan ki gen maladi asymptomatic.
Gen yon bezwen ijan pou zouti byomarkè ki baze sou sistèm pou pi byen mezire ak vize divès fizyoloji dèyè AD. Yo espere zouti sa yo pa sèlman chanje kad dyagnostik AD nou an, men tou, ankouraje adopsyon estrateji tretman efikas, espesifik pou pasyan (1, 2). Pou sa ka fèt, nou aplike yon apwòch pwoteomik konplè san patipri nan sèvo AD ak CSF pou idantifye biomaketè CSF ki baze sou entènèt ki reflete yon pakèt fizyoloji ki baze sou sèvo. Analiz nou an te pwodwi senk panno biomarker CSF, ki (i) reflete sinaps, veso sangen, myelin, iminitè ak disfonksyon metabolik; (ii) demontre repwodiksyon fò sou diferan platfòm MS; (iii) Montre chanjman pwogresif espesifik maladi a nan etap bonè ak an reta nan AD. An jeneral, rezilta sa yo reprezante yon etap pwomèt nan direksyon pou devlopman divès, serye, zouti biomarker ki oryante sou entènèt pou rechèch AD ak aplikasyon klinik.
Rezilta nou yo demontre òganizasyon an trè konsève nan pwoteòm rezo sèvo AD yo ak sipòte itilizasyon li kòm yon jete lank pou devlopman byomarkè ki baze sou sistèm. Analiz nou an montre ke de ansanm done endepandan TMT-MS ki gen sèvo AD ak AsymAD gen gwo modilarite. Konklizyon sa yo pwolonje travay anvan nou an, demontre prezèvasyon modil pwisan nan plis pase 2,000 tisi nan sèvo ki soti nan plizyè kowòt endepandan nan cortical frontal, parietal, ak tanporèl (17). Rezo konsansis sa a reflete divès kalite chanjman ki gen rapò ak maladi yo obsève nan rechèch aktyèl la, ki gen ladan ogmantasyon modil enflamatwa glial ki rich ak diminisyon modil newòn ki rich. Menm jan ak rechèch aktyèl la, rezo sa a gwo echèl tou prezante chanjman modilè enpòtan nan AsymAD, ki montre yon varyete diferan fizyopatoloji preklinik (17).
Sepandan, nan kad sa a ki baze sou sistèm ki trè konsèvatif, gen plis eterojenite byolojik ki gen anpil grenn, espesyalman nan mitan moun ki nan premye etap yo nan AD. Panèl biomarker nou an kapab dekri de sougwoup nan AsymAD, ki demontre ekspresyon diferans enpòtan plizyè makè CSF. Gwoup nou an te kapab mete aksan sou diferans ki genyen byolojik ant de sougwoup sa yo, ki pa t evidan nan nivo biomaketè AD debaz yo. Konpare ak gwoup kontwòl la, rapò Aβ1-42/total tau moun AsymAD sa yo te ba nòmalman. Sepandan, sèlman nivo total tau yo te siyifikativman diferan ant de sougwoup AsymAD yo, pandan y ap nivo Aβ1-42 ak p-tau yo te rete relativman konparab. Depi segondè CSF tau sanble yo dwe yon pi bon prediktè nan sentòm mantal pase nivo Aβ1-42 (7), nou sispèk ke de kòwòt AsymAD yo ka gen diferan risk pou pwogresyon maladi. Etandone gwosè echantiyon limite AsymAD nou an ak mank de done longitudinal, gen plis rechèch ki nesesè pou tire konklizyon sa yo avèk konfyans. Sepandan, rezilta sa yo endike ke yon panèl CSF ki baze sou sistèm ka amelyore kapasite nou pou stratifye endividi yo efektivman pandan etap asymptomatik maladi a.
An jeneral, rezilta nou yo sipòte wòl miltip fonksyon byolojik nan patojèn nan AD. Sepandan, metabolis enèji dysregulated te vin tèm enpòtan nan tout senk panno etikèt valide nou yo. Pwoteyin metabolik, tankou hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) ak laktat dehydrogenase A (LDHA), se biomarkers sinaptik ki pi solid ki valide, ki endike ke ogmantasyon nan AD CSF se sèks trè repwodiktif. Veso sangen nou yo ak panno glial yo genyen tou plizyè makè ki enplike nan metabolis sibstans oksidatif yo. Konklizyon sa yo konsistan avèk wòl kle pwosesis metabolik yo jwe nan tout sèvo a, pa sèlman pou satisfè demann enèji segondè newòn yo, men tou pou satisfè demann enèji segondè nan astwosit ak lòt selil glial (17, 48). Rezilta nou yo sipòte prèv k ap grandi ke chanjman nan potansyèl redox ak entèripsyon nan chemen enèji yo ka lyen debaz ant plizyè pwosesis kle ki enplike nan patojèn nan AD, ki gen ladan maladi mitokondriyo, enflamasyon glial-medyatè, ak domaj vaskilè (49). Anplis de sa, biomarkers likid serebrospinal metabolik yo genyen yon gwo kantite pwoteyin diferansye rich ant kontwòl nou an ak sougwoup AsymAD ki tankou AD, ki sijere ke dezòd enèji ak wout redox sa yo ka kritik nan etap preklinik maladi a.
Tandans diferan nan sèvo ak likid serebrospinal panèl nou te obsève yo gen tou enteresan enplikasyon byolojik. Sinaps ak metabolom ki rich nan newòn yo montre nivo diminye nan sèvo AD ak ogmante abondans nan likid serebrospinal. Etandone ke newòn yo rich nan mitokondri ki pwodui enèji nan sinaps yo bay enèji pou anpil siyal espesyalize yo (50), se resanblans nan pwofil yo ekspresyon de gwoup newòn sa yo. Pèt la nan newòn ak ekstrizyon nan selil ki domaje ka eksplike tandans sa yo nan sèvo ak CSF panèl nan maladi pita, men yo pa ka eksplike chanjman panèl yo byen bonè nou obsève (13). Youn nan eksplikasyon posib pou rezilta sa yo nan maladi asymptomatik bonè se koupe anòmal sinaptik. Nouvo prèv nan modèl sourit sijere ke fagositoz sinaptik microglia-medyatè ka anòmal aktive nan AD epi mennen nan pèt sinaps bonè nan sèvo a (51). Sa a materyèl sinaptik jete ka akimile nan CSF, ki se poukisa nou obsève ogmantasyon nan CSF nan panèl la newòn. Koupe sinaptik iminitè-medyatè ka tou pasyèlman eksplike ogmantasyon nan pwoteyin glial nou obsève nan sèvo a ak likid serebrospinal pandan tout pwosesis maladi a. Anplis koupe sinaptik, an jeneral anomali nan chemen ekzozitik la ka mennen tou nan diferan ekspresyon nan sèvo ak CSF makè newòn yo. Yon kantite etid yo te montre ke kontni an nan exosomes nan patojèn nan sèvo AD te chanje (52). Chemen ekstraselilè a tou patisipe nan pwopagasyon Aβ (53, 54). Li se vo anyen ke repwesyon nan sekresyon ekzosomal ka diminye patoloji AD-tankou nan AD modèl sourit transjenik (55).
An menm tan an, pwoteyin nan panèl vaskilè a te montre yon ogmantasyon modere nan sèvo AD, men siyifikativman diminye nan CSF la. Disfonksyon baryè san-sèvo (BBB) ka an pati eksplike rezilta sa yo. Anpil etid endepandan postmortem sou moun te demontre dekonpozisyon BBB nan AD (56, 57). Etid sa yo konfime divès aktivite nòmal ki antoure kouch selil andotelyal byen sele sa a, ki gen ladan flit kapilè nan sèvo ak akimilasyon perivaskilè nan pwoteyin san yo (57). Sa a ka bay yon eksplikasyon senp pou pwoteyin vaskilè ki wo nan sèvo a, men li pa ka konplètman eksplike rediksyon nan pwoteyin sa yo menm nan likid serebrospinal la. Yon posibilite se ke sistèm nève santral la ap aktivman izole molekil sa yo pou rezoud pwoblèm nan ogmante enflamasyon ak estrès oksidatif. Rediksyon nan kèk nan pwoteyin CSF ki pi grav nan panèl sa a, espesyalman sa yo ki enplike nan règleman lipoprotein, gen rapò ak anpèchman nan nivo danjere nan enflamasyon ak pwosesis la neuroprotective nan espès oksijèn reyaktif. Sa a se vre pou Paroxonase 1 (PON1), yon anzim obligatwa lipoprotein ki responsab pou diminye nivo estrès oksidatif nan sikilasyon an (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) se yon lòt makè siyifikativman desann-reglemante nan gwoup la vaskilè. Li se précurseur nan bikunin nan transpòtè lipid, ki se tou patisipe nan repwesyon enflamasyon ak Pwoteksyon newolojik (60, 61).
Malgre divès ipotèz enteresan, enkapasite a dirèkteman detekte mekanis maladi byochimik se yon limit byen li te ye nan analiz pwoteomik dekouvèt-kondwi. Se poutèt sa, plis rechèch nesesè pou defini ak konfyans mekanis ki dèyè panno biomarker sa yo. Yo nan lòd yo avanse nan devlopman nan analiz klinik ki baze sou MS, direksyon nan lavni mande tou pou yo sèvi ak metòd quantitative vize pou verifikasyon biomarker gwo echèl, tankou siveyans reyaksyon selektif oswa paralèl (62). Nou fèk itilize siveyans reyaksyon paralèl (63) pou valide anpil nan chanjman pwoteyin CSF ki dekri isit la. Plizyè objektif panèl priyorite yo mezire ak presizyon enpòtan, ki gen ladan YWHAZ, ALDOA, ak SMOC1, ki kat jeyografik nan sinaps nou an, metabolis, ak panno enflamasyon, respektivman (63). Akizisyon Done Endepandan (DIA) ak lòt estrateji ki baze sou MS kapab itil tou pou verifikasyon sib. Bud et al. (64) Dènyèman, li te demontre gen yon sipèpoze enpòtan ant biomaketè AD yo idantifye nan seri done dekouvèt CSF nou an ak seri done endepandan DIA-MS la, ki gen ladann prèske 200 echantiyon CSF ki soti nan twa diferan kòwòt Ewopeyen an. Etid resan sa yo sipòte potansyèl panno nou yo pou transfòme nan deteksyon serye ki baze sou MS. Antikò tradisyonèl ak deteksyon ki baze sou aptamer enpòtan tou pou plis devlopman nan biomaketè AD kle yo. Akòz abondans ki ba nan CSF, li pi difisil pou detekte biomake sa yo lè l sèvi avèk metòd MS ki gen gwo debi. NEFL ak NRGN se de egzanp sa yo de biomake CSF ki ba-abondans, ki trase sou panèl la nan analiz konplè nou an, men yo pa ka detekte seryezman lè l sèvi avèk yon sèl estrateji MS nou an. Estrateji vize ki baze sou plizyè antikò, tankou PEA, ka ankouraje transfòmasyon klinik makè sa yo.
An jeneral, etid sa a bay yon apwòch pwoteomik inik pou idantifikasyon ak verifikasyon biomaketè CSF AD ki baze sou diferan sistèm. Optimize panno makè sa yo atravè kowòt AD adisyonèl ak platfòm MS ka pwouve pwomèt pou avanse stratifikasyon ak tretman risk AD. Etid ki evalye nivo longitudinal panno sa yo sou tan yo enpòtan tou pou detèmine ki konbinezon makè ki pi byen stratifye risk maladi bonè ak chanjman nan severite maladi a.
Eksepte pou 3 echantiyon yo kopye pa CSF, tout echantiyon CSF yo itilize nan etid sa a yo te kolekte anba ejid Emory ADRC oswa enstitisyon rechèch ki gen rapò. Yon total de kat seri echantiyon Emory CSF yo te itilize nan syans pwoteomik sa yo. Yo te jwenn kowòt CSF la genyen echantiyon ki soti nan 20 kontwòl ki an sante ak 20 pasyan AD. CSF kopi 1 gen ladann echantiyon ki soti nan 32 kontwòl ki an sante, 31 moun AsymAD, ak 33 moun AD. CSF kopi 2 gen 147 kontwòl ak 150 echantiyon AD. Kòwòt 4 replikasyon CSF milti-maladi a te gen ladan 18 kontwòl, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, ak 11 echantiyon FTD. Dapre akò Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Emory University te apwouve a, tout patisipan etid Emory te jwenn konsantman enfòme. Dapre Enstiti Nasyonal 2014 pou Aging Pi bon Pratik Gid pou Sant alzayme a (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), likid serebrospinal yo te kolekte epi estoke pa ponksyon lonbèr. Pasyan kontwòl ak AsymAD ak AD yo te resevwa evalyasyon mantal ofisyèl nan Emory Cognitive Neurology Clinic oswa Goizueta ADRC. Echantiyon likid serebrospinal yo te teste pa INNO-BIA AlzBio3 Luminex pou ELISA Aβ1-42, total tau ak p-tau analiz (65). Valè ELISA yo itilize pou sipòte klasifikasyon dyagnostik matyè yo ki baze sou kritè ki etabli AD byomarker koupe (66, 67). Done demografik ak dyagnostik debaz pou lòt dyagnostik CSF (FTD, ALS, ak PD) yo jwenn tou nan Emory ADRC oswa enstitisyon rechèch ki afilye yo. Ou ka jwenn metadata ka rezime pou ka Emory CSF sa yo nan Tablo S1A. Karakteristik Swis CSF replikasyon 3 kòwòt yo te deja pibliye (45).
CSF jwenn echantiyon an. Yo nan lòd yo ogmante pwofondè nan dekouvèt nou an nan seri a done CSF, yo te fè konsomasyon iminitè nan gwo abondans pwoteyin anvan trypsinization. An brèf, 130 μl CSF ki soti nan 40 echantiyon endividyèl CSF ak yon volim egal (130 μl) High Select Top14 Abondans Pwoteyin Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) yo te mete nan yon kolòn vire (Thermo Fisher Scientific, A89868) nan chanm. tanperati Enkube). Apre vire pou 15 minit, santrifuje echantiyon an nan 1000g pou 2 minit. Yo te itilize yon aparèy filtre ultrasantrifujeur 3K (Millipore, UFC500396) pou konsantre echantiyon efluan an pa santrifuje nan 14,000g pou 30 minit. Delye tout volim echantiyon yo nan 75 μl ak saline tampon fosfat. Konsantrasyon pwoteyin yo te evalye pa metòd asid bicinchoninic (BCA) dapre pwotokòl manifakti a (Thermo Fisher Scientific). CSF immunodepleted (60 μl) ki soti nan tout 40 echantiyon yo te dijere ak lysyl endopeptidase (LysC) ak trypsin. Nan ti bout tan, echantiyon an te redwi ak alkylated ak 1.2 μl 0.5 M tris-2 (-carboxyethyl)-fosfin ak 3 μl 0.8 M chloroacetamide nan 90 ° C pou 10 minit, ak Lè sa a, sonike nan yon beny dlo pou 15 minit. Te echantiyon an dilye ak 193 μl 8 M tanpon ure [8 M ure ak 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] nan yon konsantrasyon final nan 6 M ure. LysC (4.5 μg; Wako) yo itilize pou dijesyon lannwit lan nan tanperati chanm. Lè sa a, echantiyon an te dilye nan 1 M ure ak 50 mM bikabonat amonyòm (ABC) (68). Ajoute yon kantite egal (4.5 μg) nan tripsin (Promega), ak Lè sa a, enkube echantiyon an pou 12 èdtan. Asidifye solisyon peptide dijere a nan yon konsantrasyon final 1% asid fòmik (FA) ak 0.1% asid trifluoroacetic (TFA) (66), epi answit desal ak yon kolòn 50 mg Sep-Pak C18 (Waters) jan sa dekri pi wo a (25) . Lè sa a, peptide a elite nan 1 ml 50% asetonitrile (ACN). Pou estandadize quantification pwoteyin atravè pakèt (25), 100 μl aliquot nan tout 40 echantiyon CSF yo te konbine yo jenere yon echantiyon melanje, ki te Lè sa a, divize an senk echantiyon entèn mondyal (GIS) (48). Tout echantiyon endividyèl ak estanda konbine yo seche pa vakyòm gwo vitès (Labconco).
CSF kopye echantiyon an. Dayon ak kòlèg yo te deja dekri rediksyon iminitè ak dijesyon nan echantiyon CSF kopi 3 (45, 46). Echantiyon replike ki rete yo pa t 'imininodepleted endividyèlman. Dijere echantiyon sa yo ki pa retire nan tripsin jan sa dekri deja (17). Pou chak analiz repete, 120 μl alikòt nan peptide eliye ki soti nan chak echantiyon yo te pisin ansanm epi divize an alikòt volim egal yo dwe itilize kòm estanda entèn mondyal ki make TMT (48). Tout echantiyon endividyèl ak estanda konbine yo seche pa vakyòm gwo vitès (Labconco). Pou amelyore siyal pwoteyin CSF ki ba-abondans lan, lè w konbine 125 μl nan chak echantiyon, yo te prepare yon echantiyon "amelyore" pou chak analiz repwodui [sa vle di, yon echantiyon byolojik ki imite echantiyon rechèch la, men kantite lajan ki disponib la se. pi gwo (37, 69)] fizyone nan yon echantiyon CSF melanje (17). Echantiyon an melanje te Lè sa a, immunoremoved lè l sèvi avèk 12 ml High Select Top14 Abondans Pwoteyin Retire Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), dijere jan sa dekri pi wo a, epi li enkli nan etikèt TMT ki vin apre a.
Tan pòs: Out-27-2021